發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展

段效輝，王　穎，曹　鵬，李金慶，魯　閩，劉　寧

(煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000)

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發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展

段效輝，王穎，曹鵬，李金慶，魯閩，劉寧

(煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000)

簡單介紹了發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有害物質(zhì)的機(jī)理及用于有害物質(zhì)檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌種類，綜述了發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展，包括發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)水產(chǎn)品中抗生素、重金屬、甲醛、生物毒素以及急性毒性評(píng)價(jià)等，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

發(fā)光細(xì)菌；水產(chǎn)品；有害物質(zhì)；急性毒性評(píng)價(jià)

早在17世紀(jì)70年代，有研究者發(fā)現(xiàn)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光活性可被有害物質(zhì)抑制[1]。20世紀(jì)70年代，研究者們熱衷于從海洋環(huán)境中分離獲得發(fā)光細(xì)菌，用于水質(zhì)環(huán)境有害物質(zhì)的檢測(cè)，這些發(fā)光細(xì)菌多要求對(duì)人體無害且對(duì)環(huán)境有害物質(zhì)敏感[2]。此后，發(fā)光細(xì)菌陸續(xù)被用于各種環(huán)境污染物質(zhì)檢(監(jiān))測(cè)和食品綜合毒性評(píng)價(jià)，并建立了以發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度變化為指標(biāo)的有害物質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的檢測(cè)試劑盒也陸續(xù)研制成功[3-4]。與化學(xué)分析法不同，發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法可作為有害物質(zhì)的一個(gè)初篩步驟， 如果發(fā)光細(xì)菌法未檢測(cè)到有害物質(zhì)，則不需進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)分析。當(dāng)有多種有害物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法還可幫助評(píng)估該復(fù)合污染物的毒力。為此，作者在此簡單介紹了發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有害物質(zhì)的機(jī)理、用于有害物質(zhì)檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌種類、發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品有害物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用以及急性毒性評(píng)價(jià)等，并對(duì)發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)水產(chǎn)品中有害物質(zhì)的前景進(jìn)行了展望。

1　發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有害物質(zhì)的機(jī)理

研究認(rèn)為，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光是由特異性的熒光酶(LE)、還原性的黃素(FMNH2)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)、氧分子等參與的復(fù)雜反應(yīng)[5-7]。發(fā)光細(xì)菌與有害物質(zhì)接觸后發(fā)光強(qiáng)度會(huì)受到抑制，其機(jī)理主要分為2種[8]：直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶的活性和通過細(xì)胞質(zhì)毒性抑制細(xì)胞代謝過程。有害物質(zhì)可通過單獨(dú)一種或兩種機(jī)理同時(shí)影響發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度。基于此，一般將發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有害物質(zhì)或進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)分為直接法和生長法。直接法是將一定濃度的發(fā)光細(xì)菌直接接種到有害物質(zhì)溶液中，能立刻檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的變化；生長法則是將正常發(fā)光強(qiáng)度的發(fā)光細(xì)菌接種到有害物質(zhì)溶液中，經(jīng)過一段時(shí)間的生長增殖后檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的變化或在整個(gè)生長增殖階段監(jiān)測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的變化。

2　用于有害物質(zhì)檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌

目前，用于有害物質(zhì)檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌主要分布于4個(gè)屬，這些發(fā)光細(xì)菌都能夠在正常的生理?xiàng)l件下發(fā)射波長在450～490nm之間的可見熒光。發(fā)光細(xì)菌與有害物質(zhì)接觸后，其發(fā)出的可見熒光強(qiáng)度即發(fā)生變化，通過其變化程度，可測(cè)定有害物質(zhì)的濃度或急性毒性[9]。用于有害物質(zhì)檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌有[10-13]：

(1)弧菌屬(Vibrio)：哈維氏弧菌(V. harveyi)、美麗弧菌生物型(V.splendidusbiotype Ⅰ)、費(fèi)氏弧菌(V. fischeri)、火神弧菌(V. logei)、東方弧菌(V. orientalis)、青海弧菌(V.qinghaiensis)、霍亂弧菌(V.cholerae)和地中海弧菌(V. mediterratanei)中的某些菌株。

(2)發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)：明亮發(fā)光桿菌(P. phosphoreum)、鰒發(fā)光桿菌(P. leiognathi)。

(3)希瓦氏菌屬(Shewanella)： 羽田希瓦氏菌(S. hanedai)。

(4)異短桿菌屬(Xenorhabdus)：發(fā)光異短桿菌(X. luminescens)。

以上菌屬多數(shù)來自于海洋環(huán)境，僅較少量的發(fā)光細(xì)菌(如發(fā)光異短桿菌、青海弧菌、霍亂弧菌)屬于淡水發(fā)光菌。由于特定的來源和發(fā)光特性，發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品及海水環(huán)境有害物質(zhì)的監(jiān)(檢)測(cè)中應(yīng)用日益廣泛。

3　發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，魚類疫病不可避免。養(yǎng)殖水域由于漁藥的任意使用，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量的影響也越來越大。在水產(chǎn)品加工、儲(chǔ)藏過程中，為了保障水產(chǎn)品衛(wèi)生水平，一些保鮮劑、消毒劑的不規(guī)范使用也可能導(dǎo)致有害物質(zhì)殘留。由于發(fā)光細(xì)菌對(duì)有害物質(zhì)的生物毒性的高度敏感和易于監(jiān)測(cè)，研究者利用發(fā)光細(xì)菌建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品加工中常見有害物質(zhì)(如抗生素、重金屬、甲醛、生物毒素等)的檢測(cè)體系和急性毒性評(píng)價(jià)方法[14]。

3.1檢測(cè)水產(chǎn)品中有害物質(zhì)

3.1.1檢測(cè)抗生素

抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中濫用情況最嚴(yán)重的一類化合物[15]。發(fā)光細(xì)菌在以氯霉素、四環(huán)素為代表的抗生素檢測(cè)中得到了較好的應(yīng)用。朱蘭蘭等[16-17]、王亞群等[18]篩選到適合于水產(chǎn)品中氯霉素檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌，并建立了水產(chǎn)品中氯霉素的發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)體系，該檢測(cè)體系是基于發(fā)光細(xì)菌的敏感狀態(tài)及與氯霉素作用時(shí)間建立的，具有靈敏度高、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)，且成本低、操作簡單快速，擺脫了大型儀器的限制。朱金國等[19]以明亮發(fā)光桿菌為指示物，研究了鹽酸金霉素、土霉素等四環(huán)素族抗生素對(duì)明亮發(fā)光桿菌T3變種的發(fā)光抑制效應(yīng)，建立了相關(guān)的線性方程，靈敏度比傳統(tǒng)杯碟法高5倍，具有快速、簡便的特點(diǎn)，可快速、靈敏地檢測(cè)食品中殘留抗生素。

3.1.2檢測(cè)重金屬

眾所周知，水生生物具有較強(qiáng)的富集重金屬的能力，水產(chǎn)品重金屬污染已成為消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)[20]。Thomulka等[8]研究了發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)水中重金屬的可行性，并對(duì)直接法和生長法的有效性進(jìn)行評(píng)估比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法都可用于水中重金屬檢測(cè)，且都比傳統(tǒng)的微生物毒性檢測(cè)方法敏感，其中，生長法對(duì)有害物質(zhì)的敏感度更高，能更準(zhǔn)確地檢測(cè)有害物質(zhì)。

3.1.3檢測(cè)甲醛及生物毒素

束琴霞等[21]利用青海弧菌Q67建立了一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中甲醛的方法，可在5 min內(nèi)檢測(cè)甲醛毒性，為水產(chǎn)品中殘留的甲醛現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、監(jiān)管提供了可靠的技術(shù)保障。

真菌毒素、細(xì)菌毒素是食品中常見生物毒素，采用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)水產(chǎn)品中生物毒素殘留是發(fā)光細(xì)菌研究的新方向。劉彩琴等[22]以從深海環(huán)境分離得到的發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)4種真菌毒素，發(fā)現(xiàn)發(fā)光細(xì)菌對(duì)黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A敏感度低，但對(duì)玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)效果良好[22]。

3.2急性毒性評(píng)價(jià)

近年來，以發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)的研究得到了較快發(fā)展，尤其是在環(huán)境保護(hù)及其處理效果評(píng)估等方面得到很好的應(yīng)用。Girotti等[23]在對(duì)被烴類化合物污染的水和土壤進(jìn)行生物修復(fù)后，利用3株海洋發(fā)光細(xì)菌監(jiān)測(cè)了污染水和土壤的生物毒性變化過程，同時(shí)利用氣相色譜對(duì)污染水和土壤中的烴濃度進(jìn)行檢測(cè)，從而證明了發(fā)光細(xì)菌的急性毒性評(píng)價(jià)方法的可行性。這一研究給水產(chǎn)品加工措施提供了急性毒性評(píng)價(jià)手段。

3.2.1對(duì)水產(chǎn)品中有害物質(zhì)的急性毒性評(píng)價(jià)

若多種有害物質(zhì)均對(duì)發(fā)光細(xì)菌具有抑制作用，則毒性作用可表現(xiàn)為疊加效應(yīng)。另外，當(dāng)外界有害物質(zhì)濃度發(fā)生變化時(shí)，其對(duì)發(fā)光細(xì)菌急性毒性也隨之發(fā)生變化，從而導(dǎo)致發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的變化。因此，對(duì)環(huán)境或樣品的毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)或評(píng)價(jià)也是發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全方面的重要應(yīng)用。

馬靜等[24]同時(shí)研究了幾種抗生素和重金屬對(duì)發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾種有害物質(zhì)兩兩聯(lián)合對(duì)發(fā)光細(xì)菌均顯示出毒性疊加作用，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。該急性毒性分析方法較傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(小鼠法、大鼠法)靈敏度高、耗時(shí)短，可滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖預(yù)警及污染突發(fā)事件應(yīng)急分析方面的需求，是利用發(fā)光細(xì)菌評(píng)價(jià)急性毒性的重要應(yīng)用。石穎等[25]以淡水發(fā)光細(xì)菌青海弧菌Q67為發(fā)光指示菌，分析評(píng)價(jià)了呋喃唑酮、左氧氟沙星等8種獸藥對(duì)發(fā)光細(xì)菌的作用規(guī)律及急性毒性效應(yīng)，也是利用發(fā)光細(xì)菌對(duì)有害物質(zhì)進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)的有意義的嘗試。吳淑杭等[26]研究了汞、鉻、鎘等3種重金屬對(duì)海水發(fā)光細(xì)菌明亮發(fā)光桿菌的單因子毒性效應(yīng)和二元重金屬混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)，揭示了2種重金屬共存時(shí)生物毒性疊加以及毒性效應(yīng)的主因子作用。

3.2.2對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖表層沉積物和海洋沉積物的綜合毒性監(jiān)測(cè)

水產(chǎn)養(yǎng)殖表層沉積物由飼料、飼用抗生素、動(dòng)物排泄物、寄生生物、微生物分泌物等多種成分組成，是影響?zhàn)B殖環(huán)境安全的重要因素。對(duì)表層沉積物的綜合毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)可有效保障水產(chǎn)養(yǎng)殖水域環(huán)境安全。許道艷等[27]利用發(fā)光細(xì)菌監(jiān)測(cè)海洋沉積物綜合毒性獲得了滿意的效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖、海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)等提供了便捷有效的技術(shù)保障。

4　發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法存在的問題

發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法所具有的方便、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)、水產(chǎn)品有害物質(zhì)檢測(cè)及急性毒性評(píng)價(jià)等方面?zhèn)涫苤匾暎绕湓谒a(chǎn)品質(zhì)量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)監(jiān)管以及環(huán)境監(jiān)測(cè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。但該法亦存在不足：

(1)特異性不強(qiáng)。首先，由于發(fā)光細(xì)菌對(duì)上千種毒性物質(zhì)反應(yīng)靈敏[28]，屬于廣譜性抑制，因此利用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有害物質(zhì)的特異性不強(qiáng)。對(duì)此，可以從兩方面提高該方法的特異性：一是改進(jìn)樣品前處理方法，通過優(yōu)化其提取條件，提高樣品前處理的回收率和提純率[17]；二是從發(fā)光細(xì)菌自身基因水平出發(fā)，采用現(xiàn)代基因工程技術(shù)，提高發(fā)光細(xì)菌對(duì)有害物質(zhì)的響應(yīng)特異性。Trang等[29]利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了重組發(fā)光細(xì)菌E.coliDH 5α(pJAMA-arsR)，該發(fā)光細(xì)菌能夠在砷誘導(dǎo)下發(fā)出特異性熒光，大大提高其檢測(cè)特異性。

(2)重現(xiàn)性不佳。由于細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度差異較大，利用發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)需要使用新鮮培養(yǎng)物，以確保細(xì)胞活性。細(xì)胞復(fù)蘇過程會(huì)影響細(xì)胞活性，如何以合適的細(xì)胞活性保存技術(shù)保障細(xì)胞發(fā)光活性的穩(wěn)定性仍需要進(jìn)一步研究。目前，細(xì)胞活性保存的最佳方法是冷凍干燥法[30-31]。冷凍干燥過程中的保護(hù)劑選擇、冷凍干燥條件的選擇和優(yōu)化是重點(diǎn)研究內(nèi)容。

5　結(jié)語

水產(chǎn)品的安全離不開水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)控、水產(chǎn)品加工措施效果評(píng)估以及水產(chǎn)品有害物質(zhì)檢測(cè)。針對(duì)發(fā)光細(xì)菌的實(shí)際特點(diǎn)，研究者正不斷完善其不足，發(fā)揮其技術(shù)優(yōu)勢(shì)，使其在水產(chǎn)品安全應(yīng)用中的適應(yīng)性更強(qiáng)，一些以發(fā)光細(xì)菌為基礎(chǔ)的生物傳感器也在不斷研究、建立和改進(jìn)。隨著現(xiàn)代儀器和光電子技術(shù)的發(fā)展，發(fā)光細(xì)菌技術(shù)、現(xiàn)代基因工程技術(shù)與熒光、紫外等大型分析儀器相結(jié)合，將為發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供有力保障。

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Research Progress on Luminescent Bacteria in Safety of Aquatic Products

DUAN Xiao-hui,WANG Ying,CAO Peng,LI Jin-qing,LU Min,LIU Ning

(YantaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yantai264000,China)

Themechanismofpoisonouscomponentsdetectionbyluminescentbacteriaandtypesofluminescentbacteriawereintroduced.Researchprogressonluminescentbacteriainsafetyofaquaticproductswasreviewed,includingthedetectionofantibiotics,heavymetals,formaldehyde,andbiotoxinbyluminescentbacteria,andacutetoxicityevaluation.Andtheapplicationprospectwasforecasted.

luminescentbacterium;aquaticproducts;poisonouscomponent;acutetoxicityevaluation

國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2015IK200)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.002

Q 939.1X 830.2

A

1672-5425(2016)10-0008-04

段效輝，王穎，曹鵬，等.發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(10)：8-11.