間歇低氧-肺氣腫大鼠的炎癥及免疫反應特點研究

韓雙羽,李彩麗,馮靖△,王玉寶△

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間歇低氧-肺氣腫大鼠的炎癥及免疫反應特點研究

韓雙羽1,李彩麗2,馮靖2△,王玉寶1△

摘要:目的建立間歇低氧(IH)-肺氣腫大鼠模型，探討其引起炎癥和免疫反應的特點。方法60只Wistar大鼠隨機分成對照組、肺氣腫組、IH組和重疊組(肺氣腫合并IH組)。每組15只。造模成功后使用流式細胞儀測定各組外周血中性粒細胞（PMN）、CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4+T細胞凋亡率水平。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定血漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素（IL）-6水平。取大鼠肺泡灌洗液(BALF)，在光鏡下計算巨噬細胞、外周血PMN和淋巴細胞比例。采集肺、肝臟、胰腺組織和右頸動脈并進行病理評分。結果重疊組中PMN、CD3+CD8+T細胞凋亡率與其他3組相比較低，CD3+CD4+T細胞凋亡率、TNF-α、IL-6表達水平最高（均P < 0.05）。BALF中，肺氣腫組巨噬細胞和PMN百分比高于其余3組（均P < 0.05）。重疊組中肺、肝臟、胰腺、右頸動脈內中膜厚度的病理評分高于其他3組（均P < 0.05）。結論肺氣腫合并IH可產生更嚴重的系統性多器官炎癥和免疫反應。

關鍵詞:肺氣腫；炎癥；免疫；間歇低氧；重疊綜合征

慢性阻塞性肺疾病（COPD）與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSA）在呼吸系統疾病中往往共存，被稱為重疊綜合征(OS)，由Flenley于1985年首先提出。OS可以使系統性炎癥反應和心血管疾病的風險增加[1]，在年齡>40歲的人群中發病率為0.5%～1.0%[2]。與單純OSA或COPD患者相比，OS患者低氧程度、高碳酸血癥程度更為嚴重，發展為肺動脈高壓、慢性肺源性心臟病的概率增加[3-4]。本研究通過建立間歇低氧(IH)-肺氣腫大鼠模型，觀察大鼠系統性炎癥及免疫反應的發生情況，旨在探討OSA與COPD的共同作用與相互影響，深入理解OS的內在特征與可能的發病機制。

1　資料與方法

1.1一般資料60只4周齡健康SPF級Wistar大鼠，雄性，體質量120～150 g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所動物模型中心。光學顯微鏡（日本OLYMPUS BX4.0）；數碼相機（日本佳能公司）；多功能彩色病理圖像分析系統（北京航空航天大學）；氣體氧濃度監測器（瑞士夏美頓公司）；低流量流速表（余姚工業自動化儀表廠）；氧氣減壓器（天津減壓器廠）；熏箱為玻璃箱改制（85 cm×70 cm×55 cm），低氧艙為大號密封盒改制；混合氣體（天津六方氣體公司）；酶標儀（美國Model550microplate Reader,Bio-Rad）；臺式冷凍離心機（德國Heraeus公司）；倒置顯微鏡（德國Zeiss,Axiorert200）；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6,酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Invitrogen公司）；大前門烤煙型香煙（上海卷煙廠生產）；臺盼藍染色液（上海地申生物科技有限公司）；AnnexinV-PE凋亡試劑盒（美國eBioscince公司）；流式細胞儀、細胞分離液Histopaque1119、Histopaque1083、大鼠粒細胞標記物FITC、大鼠淋巴細胞標記物（美國BD公司）；吉姆薩染液、瑞氏染液（南京建成生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制作60只大鼠隨機分成4組，每組15只，暴露方法及模型建立標準均參照課題組既往研究[5-6]。對照組：假熏煙暴露和間歇正常氧暴露。IH組：假熏煙暴露和IH暴露。肺氣腫組：熏煙暴露和間歇正常氧暴露。重疊組：熏煙暴露和IH暴露。模型均建立成功。

1.2.2外周血中性粒細胞（PMN）、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞凋亡率測定使用AnnexinV-PE凋亡率檢測試劑盒，按照操作說明書使用密度梯度離心法分離外周血單核細胞和PMN，重懸后分別加入粒細胞標志物、CD3-Ab和CD4-Ab、CD3-Ab和CD8-Ab，孵育清洗后，先后加入AnnexinV和7-AA，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，每份標本收集細胞數20 000個，計算凋亡細胞的百分率。

1.2.3TNF-α、IL-6表達水平檢測取大鼠外周血，使用Quantakine?試劑盒，根據試劑盒手冊進行ELISA測定。

1.2.4大鼠肺泡灌洗液（BALF）中各炎癥細胞百分比檢測將大鼠麻醉后行開胸術，于氣管分叉上方結扎右主支氣管，左肺行氣管灌洗，回收灌洗液，一份灌洗液使用血細胞計數儀測定細胞總數及白細胞總數。另一份灌洗液經500×g離心5min后，制片，改良Wright-Giemsa染色后，使用光學顯微鏡（×100）測定巨噬細胞、PMN和淋巴細胞的百分比，分類計數檢測判斷標準均參照美國胸科協會官方指南進行[7]。

1.2.5肺、肝、胰腺及頸動脈炎癥病理學評價使用10%福爾馬林浸潤右肺，切取肺組織，行剖腹手術和頸部切開術，提取肝臟、胰腺和右頸動脈組織塊，置于4%甲醛溶液中固定，于24h內行石蠟包埋,行4 μm切片后，常規蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察組織形態。為了客觀度量，本研究進行了隨機分層病理切片，采用文獻[8]方法對病理結果進行量化評分，包括平均線性截距（MLI），平均肺泡數（MAN）和肺部、肝臟（近肝門區）、胰腺炎癥病理得分，使用病理圖像分析系統測量大鼠右頸動脈內中膜厚度占整個血管壁厚百分比(內中膜厚度百分比)。

1.3統計學方法采用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗,以P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1外周血PMN、CD3+CD4+T及CD3+CD8+T細胞凋亡率重疊組PMN及CD3+CD8+T細胞凋亡率最低，對照組最高；重疊組CD3+CD4+T細胞凋亡率最高，對照組最低（均P < 0.05），見表1、圖1～3。

Tab.1　The apoptotic rates of PMN, CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in peripheral blood in four groups of rats表1　各組大鼠外周血PMN、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞凋亡率　（n=15，%，±s）

Tab.1　The apoptotic rates of PMN, CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in peripheral blood in four groups of rats表1　各組大鼠外周血PMN、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞凋亡率　（n=15，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與IH組比較，c與肺氣腫組比較，均P＜0.05

組別對照組IH組肺氣腫組重疊組F PMN 30.87±1.65 22.71±1.47a19.45±1.61ab8.54±2.55abc244.23＊＊CD3+CD4+T 13.02±1.18 20.65±1.31a18.49±1.67ab22.62±1.55abc87.18＊＊CD3+CD8+T 31.75±1.53 23.65±1.29a28.42±1.45ab18.42±1.16abc166.35＊＊

A～D分別為對照組、IH組、肺氣腫組及重疊組Fig.1　Flow cytometric analysis for early-stage apoptotic neutrophils from rat PMNs in four groups圖1　各組大鼠外周血PMN凋亡流式細胞分析結果

A～D分別為對照組、IH組、肺氣腫組及重疊組Fig.2　Flow cytometric analysis for early-stage apoptotic CD3+CD4+T lymphocytes from rat PBMC in four groups圖2　各組大鼠CD3+CD4+T淋巴細胞凋亡流式細胞分析結果

A～D分別為對照組、IH組、肺氣腫組及重疊組Fig.3　Flow cytometric analysis for early-stage apoptotic CD3+CD8+T lymphocytes from rat PBMCs in four groups圖3　各組大鼠CD3+CD8+T淋巴細胞凋亡流式細胞分析結果

2.2各組大鼠TNF-α、IL-6表達水平比較TNF-α 和IL-6的表達水平為重疊組＞肺氣腫組＞IH組＞對照組（均P < 0.05），見表2。

2.3各組大鼠BALF中炎癥細胞百分比比較肺氣腫組巨噬細胞和PMN百分比高于其余3組（均P < 0.05）。重疊組淋巴細胞百分比與IH組差異無統計學意義，與其他2組間比較差異均有統計學意義（均P < 0.05），見表3。

2.4肺、肝臟、胰腺、右頸動脈炎癥病理學評價肺氣腫組和重疊組大鼠的病理學特征明顯，表現為肺組織間質增厚和薄壁組織炎癥，MAN減少，MLI增加，大量炎癥細胞浸潤；對照組肝臟病理基本正常，IH組表現為輕微炎癥，肺氣腫組、重疊組肝細胞呈氣球樣變且伴有炎性細胞浸潤，見圖4。肺、肝臟、胰腺、內中膜厚度的病理評分中，重疊組均高于其他3組，對照組各項評分在4組之中最低，IH組低于肺氣腫組(均P < 0.05)，見表4。

Tab.2　Comparison of blood levels of TNF-α and IL-6 in four groups of rats表2　各組TNF-α、IL-6表達水平比較（n=15，ng/L，±s）

Tab.2　Comparison of blood levels of TNF-α and IL-6 in four groups of rats表2　各組TNF-α、IL-6表達水平比較（n=15，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與IH組比較，c與肺氣腫組比較，均P＜0.05

組別對照組IH組肺氣腫組重疊組F TNF-α 16.47±2.25 48.59±3.20a62.58±4.80ab76.89±7.77abc270.51＊＊IL-6 109.71±7.84 264.57±16.69a478.60±12.23ab683.52±20.23abc2792.10＊＊

Tab.3　Cellular profiles of BALF in four groups of rats表3　各組大鼠BALF各炎癥細胞比例（n=15,%,±s）

Tab.3　Cellular profiles of BALF in four groups of rats表3　各組大鼠BALF各炎癥細胞比例（n=15,%,±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與IH組比較，c與肺氣腫組比較，均P＜0.05

組別對照組IH組肺氣腫組重疊組F巨噬細胞73.55±9.85 45.45±4.37a75.25±2.53ab36.75±6.86abc90.34＊＊PMN 1.60±1.17 1.30±1.90 14.90±3.06ab2.75±1.92c94.69＊＊淋巴細胞24.85±10.50 53.25±5.51a9.85±2.36ab60.50±7.94ac108.31＊＊

3　討論

PMN凋亡延遲可使PMN生存期延長，是導致慢性炎癥和器官、組織損傷非常重要的機制[9-11]。缺氧和促炎癥細胞因子等均可以使PMN凋亡延遲，但會生產更多數量的活性氧，造成器官和組織的慢性損傷[12]。PMN凋亡延遲引發的肺和氣管持久性炎癥是COPD發病機制的關鍵階段，而IH反復發作患者出現心血管并發癥亦與PMN凋亡延遲引起的活性氧累積增加密切相關[13]。本研究顯示，COPD組和IH組的PMN凋亡率均比對照組低，而重疊組最低，表明COPD和IH均可導致明顯的PMN凋亡延遲，而COPD與IH共同存在則進一步抑制了PMN的凋亡，可能會造成更為嚴重的器官和組織損傷，這對于全身炎癥反應較為嚴重的OS患者具有重要的病理生理意義。

CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞是異常免疫反應的關鍵，它們的分化或功能的破壞會導致自身免疫疾病和炎癥。近期研究表明，當CD3+CD8+T細胞凋亡減少時，CD3+CD4+T細胞凋亡水平增加，并且這種免疫異常與COPD患者氣道病理過程有關[14]。OSA患者扁桃腺CD3+CD8+T細胞的增殖與促炎細胞因子的較高表達和釋放相關，可以促進局部炎癥的發展[15]。以上證據表明COPD和OSA患者均可能具有免疫異常。本研究顯示，與對照組相比，重疊組CD3+CD8+T細胞凋亡明顯減少，而CD3+CD4+T細胞凋亡明顯增多，肺氣腫組和IH組CD3+CD4+T細胞居中，提示OS患者存在更為嚴重的免疫異常。

肺（HE，×40）、肝（HE，×100）、右頸總動脈（HE，×40）、胰腺（HE，×400）及支氣管肺泡灌洗液細胞組織（改良Wright-Giemsa染色，×100）Fig.4　Histological photographs of tissues in different groups圖4　各組大鼠不同組織部位病理掃描結果

Tab.4　Comparison of pathological scores in lung, liver, pancreas and carotid artery in four groups of rats表4　各組大鼠病理評測結果比較　（n=15,±s）

Tab.4　Comparison of pathological scores in lung, liver, pancreas and carotid artery in four groups of rats表4　各組大鼠病理評測結果比較　（n=15,±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與IH組比較，c與肺氣腫組比較，均P＜0.05

組別對照組IH組肺氣腫組重疊組FmAN(個/mm2) 169.97±5.09 164.37±8.55 103.43±4.24ab83.68±4.39abc270.50＊＊MLI(μm) 41.53±1.61 43.12±2.08 91.14±2.50ab98.41±3.93abc1289.08＊＊肺(%) 10.30±1.95 19.20±1.18a55.00±4.52ab74.60±4.17abc812.68＊＊別組對照組IH組肺氣腫組重疊組F肝臟(%) 8.00±1.49 13.60±2.95a58.00±4.62ab80.00±6.33abc672.50＊＊胰腺(%) 7.00±2.58 18.50±4.74a51.50±5.30ab77.50±4.86abc508.40＊＊內中膜厚度百分比(%) 48.84±1.29 54.00±1.80a60.72±3.24ab72.06±3.66abc139.83＊＊

TNF-α和IL-6等促炎細胞因子在宿主防御和心血管疾病中都有著極其重要的作用，其在血漿中水平升高通常是全身炎癥反應的重要標志。研究顯示，COPD患者的肺和血漿中TNF-α或IL-6水平均增加，證實了全身性炎癥是COPD發病機制的重要組成部分[16]。本研究顯示，肺氣腫組和IH組血漿TNF-α和IL-6水平較對照組均升高，表明2組大鼠均出現了明顯的全身炎癥反應，而重疊組的這兩項指標水平最高，提示吸煙暴露和IH兩種因素的疊加使全身炎癥反應較單一因素更為嚴重。

臨床研究發現，COPD患者BALF中PMN的數量較正常人群增加[17]。與之相近，本研究亦發現肺氣腫組BALF中的PMN比例高于其他組；IH組和重疊組BALF中PMN的比例較低，其原因可能是IH引起淋巴細胞持續增多所致。筆者既往研究已經證實，IH暴露主要可引起淋巴細胞水平明顯上升，并與后續的炎癥過程相關[18]。

本研究病理結果顯示，COPD組和IH組都具有相似的血管病理改變，即右頸動脈內中膜厚度較對照組明顯增加，這與對臨床患者的觀察結果是相同的[19-20]。值得強調的是，與其他3組相比，重疊組肺、肝臟、胰腺、內中膜厚度的病理評分最高，考慮這可能與PMN凋亡延遲、CD3+CD8+T細胞異常增加以及血漿中TNF-α和IL-6水平明顯升高有關，再一次證實COPD和IH兩種因素疊加會導致更為嚴重的全身炎癥反應和器官損傷，提示OS患者與單純患一種疾病相比預后可能更差。

綜上所述，本研究成功地建立了COPD、IH和OS的動物模型，明確地呈現出COPD和IH的炎癥、免疫、病理等特征，并且發現OS產生了更嚴重的系統性多器官炎癥和免疫反應，為開展更為深入的研究奠定了良好的基礎。

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（2015-06-24收稿2015-07-17修回）

（本文編輯陸榮展）

Inflammatory and immune responses in a ratmodel of intermittenthypoxia - emphysema

HAN Shuangyu1, LI Caili2, FENG Jing2△, WANG Yubao1△
1 Infective Disease Institute, The Second Affiliatedhospital of Tianjinmedical University, Tianjin 300211, China;
2 Department of Pneumology, Generalhospital of Tianjinmedical University
△Corresponding Author E-mail:wyb2046@163.com; zyyhxkfj@126.com

Abstract：Objective To develop an "overlap syndrome (OS)" ratmodel by intermittenthypoxia (IH) exposure on the base of pre-existing emphysema, and to explore its characters of severe systemic inflammation and immune responses.Methods Sixty Wistar rats were put into four groups: control group, IH group, emphysema group and overlap (emphysema+ IH) group.The peripheral blood samples were collected for detecting apoptosis of CD3+CD4+，CD3+CD8+T lymphocytes and neutrophils (PMN).Tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6 were evaluated by ELISA.The bronchoalveolar la?vage fluid (BALF) was taken to calculate the ratio ofmacrophages, neutrophils and lymphocytes under lightmicroscope.Tis?sue blocks of lung, liver, pancreas, and right carotid artery were taken for pathologic scoring.Results The apoptotic rates of PMN and CD3+CD8+T cells were significantly lower in overlap group than those of other three groups (P < 0.05).Pro-in?flammatory factor IL-6, TNF-α and peripheral blood CD3+CD4+T cell apoptosis were thehighest in overlap group com?pared to those of other three groups (P < 0.05).The ratio of PMN andmacrophages in BALF were significantlyhigher in em?physema group than those of other three groups (P < 0.05) and the pathology scores of lung, liver, pancreas, the ratio of carot?id artery intima-media thickness of whole thickness of vascular were significantlyhigher in overlap group than those of other three groups (P < 0.05).ConclusionIn ratmodel of intermittenthypoxia-emphysema there aremore serious systemicmulti-organ inflammation and immune responses.

Key words:emphysema; inflammation; immune; intermittenthypoxia; overlap syndrome

通訊作者△E-mail:wyb2046@163.com；zyyhxkfj@126.com

作者簡介：韓雙羽(1990)，女，碩士在讀，主要從事感染性炎癥疾病研究

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81270144，30800507，81170071）

中圖分類號：R563.3

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59031

作者單位：1天津醫科大學第二醫院感染性疾病研究所（郵編300211）；2天津醫科大學總醫院呼吸科