酸敏感阿霉素前藥納米粒的合成及其在治療腦膠質瘤中的作用

劉金劍，張玉民，楊翠紅，褚麗萍，黃帆，高紅林，劉鑒峰

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酸敏感阿霉素前藥納米粒的合成及其在治療腦膠質瘤中的作用

劉金劍#，張玉民#，楊翠紅，褚麗萍，黃帆，高紅林，劉鑒峰△

摘要：目的合成一類新的具有酸敏感性能的阿霉素前藥納米粒（PEG-DOX NPs），對其結構進行表征，并研究其在體外抗腦膠質瘤中的作用和透過血腦屏障的效率。方法通過席夫堿反應合成具有酸敏感的聚乙二醇-阿霉素（PEG-DOX）單體，通過自組裝制備PEG-DOX NPs。利用動態光散射（DLS）和核磁對單體進行結構表征，通過透射電鏡（TEM）對納米粒的微觀形貌進行觀察，紫外檢測法測定PEG-DOX NPs在酸性條件下的釋放行為，熒光顯微鏡觀察腦膠質瘤細胞對PEG-DOX NPs的攝取行為。利用MTT法測定PEG-DOX NPs與阿霉素（DOX）對腦膠質瘤細胞的殺傷作用。PEG-DOX NPs修飾吐溫80（PS-80）獲得PS80-PEG-DOX NPs。將9只BALB/c小鼠隨機均分為Free DOX組、PEG-DOX NPs組和PS80-PEG-DOX NPs組，利用小動物活體成像系統比較其修飾前后腦及主要臟器內DOX的熒光強度。結果PEG-DOX能夠自組裝成直徑100 nm左右的納米粒；在酸性條件下PEG-DOX NPs能夠快速釋放DOX，腫瘤細胞對PEG-DOX NPs的攝取雖然比DOX慢，但蓄積時間更長；PEG-DOX NPs和Free DOX 對C6細胞的增殖抑制均呈現濃度依賴性，PEG-DOX NPs組細胞增殖抑制率在各個濃度下均低于Free DOX組。PS-80修飾后，PS80-PEG-DOX NPs透過血腦屏障的效率顯著高于DOX和PEG-DOX NPs組。結論PEG-DOX NPs具有良好的體外抗腫瘤作用，修飾后可高效透過血腦屏障，使其體內治療腦膠質瘤成為可能。

關鍵詞：血腦屏障；阿霉素前藥；納米粒；腦膠質瘤；酸敏感

#共同第一作者

腦膠質細胞瘤簡稱腦膠質瘤(Brain glioma)，是中樞神經系統（CNS）最常見的腫瘤，發病率約為12/100 000，據文獻報道其在顱內腫瘤中所占比例為35%～60%[1-2]，是嚴重危害人類健康的疾病之一。血腦屏障（BBB）是治療腦膠質瘤疾病中遇到的最大瓶頸，其作為鄰近內皮細胞的緊密連接可以阻擋分子質量大于500 u的物質進入腦中，僅能使小分子通過被動擴散的方式進入CNS[3]。膜表面存在的特異性轉運系統能夠使營養物質進入腦內，同時能夠阻止潛在的損害CNS的毒性物質進入。BBB為保護腦組織的內環境穩態和CNS的正常生理功能提供了保障；然而這一屏障的存在也阻礙了治療藥物的輸送，為腦膠質瘤的診斷和治療帶來了極大的挑戰。本實驗針對腦膠質瘤設計并合成了具有酸敏感的前藥納米粒，通過體外包吞試驗和細胞毒性試驗，探討其抗腫瘤作用；并探討經修飾后的阿霉素前藥納米粒（PEG-DOX-NPs）能否有效透過BBB，進而為體內抗腫瘤試驗和臨床治療腦膠質瘤提供指導和實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與動物醛基化聚乙二醇（mPEG-CHO，分子質量為2 000 u）購自北京鍵凱科技有限公司；鹽酸阿霉素（DOX-HCL）購自浙江海正藥業股份有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Sigma公司；其他化學試劑均購于希恩思生化科技有限公司。大鼠神經膠質瘤C6細胞系由南開大學孔德領教授惠贈。BALB/c小鼠，SPF級，雌性，平均體質量（20.0±0.5）g，購自軍事醫學科學院[許可證號：SCXK- (軍) 2007-004]。所有動物實驗均遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2主要儀器動態光散射粒度儀（Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments,英國）；1H核磁共振波譜儀（VARIAN Unity Plus 400mHz，Varian Instruments，美國）；透射電子顯微鏡（TEM；Tecani G2 F20系統，FEI，美國）；全波長酶標儀（VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美國）；活細胞工作站（DMI6000B，Leica，德國）；小動物活體成像系統（IS In Vi?vo FX，Care-streamhealth公司，美國）。

1.2方法

1.2.1前藥納米粒單體的合成及表征稱取200mg分子質量為2 000 u的mPEG-CHO和50mg經質子化的阿霉素（DOX）[4]，將其共溶于2.0mL二甲基亞砜（DMSO）內，加入20 μL三乙胺（Et3N）作為催化劑，40℃水浴條件下震蕩反應24h，得到聚乙二醇-阿霉素（Polyethylene glycol-DOX, PEGDOX）。將反應液置于截留分子質量為1 ku的透析袋內，DMSO作為透析液，透析48h以除去未反應的DOX；再將透析液更換為pH 7.4的PBS溶液，透析48h以除去DMSO。將得到的酸敏感的前藥納米粒單體水分散液凍干，得到可再分散的凍干粉。通過1H核磁共振對PEG-DOX單體結構進行表征。

1.2.2PEG-DOX NPs的自組裝及形貌觀察稱取PEGDOX凍干粉30mg溶于2mL DMSO內，將溶液緩慢逐滴加入盛有10mL PBS（pH 7.4）的燒杯內，不斷震蕩。最后將混合溶液置于截留分子質量為3.5 ku的透析袋內，PBS（pH 7.4）作為透析液，透析48h以除去未組裝的PEG-DOX和有機溶劑DMSO，得到前藥納米粒PEG-DOX NPs。通過TEM觀察PEG-DOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h后的形貌特征。

1.2.3藥物釋放分別取2mL濃度為5.0 g/L的DOX和PEG-DOX NPs裝入截留分子質量為3.5 ku的透析袋中，并分別置于裝有50mL PBS（pH 7.4）與pH 5.0醋酸溶液的燒杯內。在恒溫37℃磁力攪拌條件下透析，于不同時間取出定量釋放液測定DOX的釋放率，同時向燒杯中補充相應體積液體。利用全波長酶標儀，紫外吸收在488 nm條件下，繪制DOX標準曲線并測定PEG-DOX NPs中DOX的濃度。利用動態光散射（DLS）測定其粒徑和表面電位，TEM觀察形貌特征。

1.2.4細胞攝取實驗取大鼠神經膠質瘤C6細胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素的RM?PI1640培養細胞，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，2～3 d換液。取對數生長期細胞以每孔5×105個鋪于12孔板內，細胞生長1 d后，向孔內加入1mL含相同DOX濃度（20mg/L）的DOX和PEG-DOX NPs，分別于孵育1.5h、4h后將孔內液體吸出，用PBS洗3次，用配制新鮮的4%多聚甲醛固定細胞10min。吸去液體并洗2次后，用5mg/L的DAPI染細胞10min，吸去液體并更新PBS，置于熒光顯微鏡下觀察DOX和PEG-DOX NPs被細胞攝取及PEG-DOX NPs中DOX的釋放行為。

1.2.5細胞增殖抑制實驗取神經膠質瘤C6細胞，培養方法參考1.2.4，取對數生長期細胞以每孔5×103個鋪于96孔板內，細胞生長24h后，向孔內分別加入濃度為0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/L DOX和PEG-DOX NPs。培養箱內孵育24h后，每孔加入20 μL的MTT溶液（5.0 g/L）繼續培養4h，吸棄上清后每孔加入150 μL DMSO溶液，充分震蕩后用酶標儀測定各孔570 nm處的吸光度（A）值。每個濃度6個平行孔，計算C6細胞的增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-樣品組A平均值/對照組A平均值）×100%。

1.2.6納米粒透過BBB實驗首先制備PS80修飾PEGDOX NPs（PS80-PEG-DOX NPs），將1%（v/v）的PS-80溶液滴加至PEG-DOX NPs溶液中，渦旋震蕩30min，現用現配。采用抽簽法將9只BALB/c小鼠隨機分為Free DOX組、PEG-DOX NPs組和PS80-PEG-DOX NPs組，各3只。每組靜脈注射劑量保持其中的DOX濃度一致，均為5.0mg/kg，于注射后8h處死并解剖小鼠，取出主要臟器，包括心、肝、脾、肺、腎和腦，利用小動物活體成像系統進行組織熒光成像及熒光定量分析。

1.3統計學方法應用SPSS 19.0軟件對數據進行分析，實驗數據采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PEG-DOX單體的合成及納米粒組裝和表征PEG-DOX單體的合成見圖1。DOX的氨基（-NH2）與PEG的醛基（-CHO）在Et3N催化條件下反應得到具有席夫堿鍵的聚合物PEG-DOX單體。mPEG-CHO與PEG-DOX的核磁圖譜見圖2，其中圖2A中9.6位置的CHO峰在圖2B中消失，證明醛基被反應掉，PEG-DOX單體成功合成。通過DLS 和TEM表征PEG-DOX NPs的粒徑約為100 nm，見圖3A，分布指數（PDI）為0.188，表面電位-5.81mV。TEM下其形貌為均一的球形，見圖3B。

Fig.1　The synthesis of PEG-DOX copolymer圖1　PEG-DOX單體的合成

Fig.2　1H NMR spectra ofmPEG-CHO (A) and PEG-DOX (B)圖2　mPEG-CHO（A）和PEG-DOX單體（B）的1H核磁圖譜

Fig.3　Hydrodynamic size distributions (A) and TEM images (B,×7 200) of PEG-DOX NPs圖3　PEG-DOX NPs的粒徑分布（A）和形貌（B;TEM,×7 200）

2.2藥物釋放PEG-DOX NPs在pH 5.0的酸性條件下48h的累積釋放率約為70%，而在pH 7.4的條件下48h的累積釋放率低于20%，見圖4A。PEGDOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h后，TEM下其形貌呈不規則形態，說明其解體后發生聚集，見圖4B。

Fig.4　Drug release profiles of PEG-DOX-Cur NPs (A) andmorphology of PEG-DOX NPs after incubation at pH 5.0 for 48h (B,×7 200)圖4　PEG-DOX NPs和DOX的釋放曲線（A）和PEG-DOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h的形貌（B; TEM,×7 200）

2.3細胞攝取實驗孵育1.5h后，Free DOX大量被細胞所攝取并直接進入核內，而PEG-DOX NPs主要分布于細胞質中，核內基本沒有DOX的熒光。在與C6細胞作用4h后，Free DOX在胞內的信號相對1.5h時明顯減弱，而PEG-DOX NPs組在細胞核內的熒光信號顯著增強，大量的DOX進入了細胞核，熒光強度明顯強于Free DOX組，表現出較強的細胞攝取性能，同時證明PEG-DOX NPs已經在細胞內降解并釋放出了DOX，見圖5。

2.4細胞增殖抑制實驗PEG-DOX NPs和Free DOX對C6細胞的增殖抑制均呈現濃度依賴性，即DOX濃度越高，其增殖抑制率越高，見圖6。PEGDOX NPs組細胞增殖抑制率在各個濃度下均低于Free DOX組（t值分別為12.70、5.14、10.20、14.04、7.31、8.85、4.29和7.38，均P < 0.05）。

2.5納米粒透過BBB實驗Free DOX、PEG-DOX NPs和PS80-PEG-DOX NPs靜脈注射8h后主要臟器的熒光成像見圖7A，可見DOX的熒光信號主要分布在肝、腎和腦中；且PS80-PEG-DOX NPs組在腦中的藥物熒光強度明顯高于PEG-DOX NPs和Free DOX組（F=108.25，n=3，P＜0.05），見圖7B，表明經PS80修飾后的PEG-DOX NPs能夠更多地透過BBB。

Fig.5　Cellular uptake and localization of Free DOX and PEG-DOX NPs inhepG 2 cancer cells圖5　C6細胞對Free DOX和PEG-DOX NPs在不同時間的攝取結果

1～8分別為0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/LFig.6　The cytotoxicity of Free DOX, and PEG-DOX NPs against C6 cancer cells圖6　PEG-DOX NPs和Free DOX對C6細胞的增殖抑制實驗

3　討論

前藥納米粒能夠有效提高疏水藥物的水溶性，延長體內循環時間，其獨特的納米結構能夠使其通過增強滲透滯留效應（EPR效應）來提高腫瘤組織中藥物富集量，同時酸敏感的特性能夠顯著降低藥物在正常組織中的釋放，從而在保證提高抗腫瘤作用的同時降低機體不良反應[5-6]。本研究中所合成的PEG-DOX單體中的DOX具有疏水性質，而PEG具有親水性，因此可以在水溶液中通過自組裝形成前藥納米粒。PEG-DOX NPs在pH 5.0條件下的DOX釋放率遠遠高于在pH 7.4條件下的釋放率，主要是因為PEG-DOX NPs的酸敏感性能所造成的，席夫堿鍵在酸性條件下會發生響應性的斷裂，從而導致PEG-DOX NPs的解體，進而釋放藥物。游離DOX為小分子，因此可以迅速透過分子質量為3.5 ku的透析袋，在短時間內幾乎完全釋放出來。這類pH響應性的化學鍵能夠保證PEG-DOX NPs在pH 7.4的血液中足夠穩定，DOX不能發揮藥效，從而對正常組織起到保護作用；而前藥納米粒一旦進入腫瘤內，由于腫瘤組織內是酸性的微環境，可以迅速將化學鍵打開，釋放大量DOX，從而可以提高對腫瘤組織的殺傷，提高藥效[7]。

a與Free DOX組比較，b與PEG-DOX NPs組比較，P < 0.05 Fig.7 The ex vivo fluorescence images of Free DOX, PEG-DOX NPs and PS80-PEG-DOX NPs (A), and themean fluorescence intensity of brain (B)圖7　Free DOX、PEG-DOX NPs及PS80-PEG-DOX NPs在小鼠體內的組織分布（A）及腦組織內單位面積平均熒光信號強度（B）

DOX對腫瘤細胞的殺傷作用主要是通過插入DNA雙螺旋結構中，進而阻止腫瘤細胞的復制，因此DOX必須進入細胞核內才能發揮藥效。MTT結果顯示Free DOX較PEG-DOX NPs具有更高的抑制腫瘤細胞增殖的效果，與常規的載藥納米粒對細胞的增殖抑制的結果一致，這主要是由于不同的細胞攝取機制導致的[8]。DOX可以直接通過被動擴散被腫瘤細胞攝取，因此可以快速進入細胞并分布于細胞核發揮藥效。前藥納米粒主要通過比較慢的胞吞作用進入細胞，進入細胞后納米粒崩解，DOX被釋放后才會發揮藥效，因此體外作用時間較短，導致藥效降低，但體內應用可以降低不良反應，而且納米粒的EPR效應能夠使更多的DOX進入腫瘤組織，將會產生比DOX更高的藥效。

前藥納米粒系統可以依賴于受體介導的內吞機制透過BBB，并將藥物遞送至腦膠質瘤[9]，即通過腦內皮原生質膜上過表達的受體，包括轉鐵蛋白受體、胰島素受體、內皮細胞生長因子受體和低密度脂蛋白受體等[10]。基于受體-配體特異性靶向結合的作用，可以選擇相關受體的配體或一些表面活性劑修飾前藥納米粒[11]，通過受體介導的內吞機制實現前藥納米粒高效透過BBB，并通過EPR效應將藥物靶向遞送至腦膠質瘤。本實驗體內組織分布結果證實，經過PS80修飾的前藥納米粒能夠有效透過BBB，腦組織的藥物濃度明顯高于未修飾組，主要原因是PS80包裹PEG-DOX NPs后，在血液循環中能夠高效地募集輔基質蛋白（ApoE），模擬低密度脂蛋白（LDL）粒子通過LDL受體介導的跨細胞作用有效穿透BBB[12]。同時經過PS80表面修飾后，能夠有效避免P-糖蛋白（P-gp）的捕捉[13]，避免了進入腦內的藥物被排出，本實驗的修飾方法比受體修飾的方法更加簡單有效。該系統有望成為臨床治療腦膠質瘤有效的前藥納米載體系統。

參考文獻

[1] Ostrom QT, Gittlemanh, Stetson L, et al.Epidemiology of gliomas [J].Cancer Treat Res, 2015, 163:1-14.doi: 10.1007/978-3-319-12048-5.

[2] Gao Y, Zhao JH.The advancement of PET/MRI on the diagnosis and treatment of brain gliomas[J].International Journal of Radiationmedicine and Nuclearmedicine, 2015, 39(1):71-74.[高艷,趙晉華.PET/MRI融合顯像在腦膠質瘤診斷和治療中的研究進展[J].國際放射醫學核醫學雜志, 2015, 39(1):71-74].doi: 10.3760 /cma.j.issn.1673-4114.

[3] Abbott NJ, Patabendige AA, Dolman DE, et al.Structure and func?tion of the blood-brain barrier[J].Neurobiol Dis, 2010, 37(1):13-25.doi:10.1016/j.nbd.2009.07.030.

[4]huang PS, SonghJ, Wang WW, et al.Integrin-targeted zwitterionic polymeric nanoparticles with acid- induced disassembly property for enhanced drug accumulation and release in tumor[J].Biomacro?molecules, 2014, 15(8):3128-3138.doi: 10.1021/bm500764p.

[5]huang P, Wang DL, Su Y, et al.Combination of smallmolecule pro?drug and nanodrug delivery: amphiphilic drug-drug conjugate for cancer therapy[J].J Am Chem Soc, 2014, 136(33):11748-11756.doi: 10.1021/ja505212y.

[6] Chen SJ, ZhanghZ, Wan LC, et al.Preparation and characteriza?tion of pH sensitive carried cisplatinmagnetic nano intelligent tar?geting drug decorated by folate[J].J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2014,35(5):657-666.[陳帥君,張宏征,萬良財,等.葉酸受體介導的載順鉑磁性納米pH敏感藥物的制備及性能[J].中山大學學報(醫學科學版), 2014, 35(5):657-666].doi: 1672-3554(2014)05-0657-10.

[7] Liu J,huang YR, Kumar A, et al.pH-sensitive nano-systems for drug delivery in cancer therapy[J].Biotechnol Adv, 2014, 32(4): 693-710.doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.11.009.

[8] Ryu JH, Bickerton S, Zhuang J, et al.Ligand-decorated nanogels: fast one-pot synthesis and cellular targeting[J].Biomacromolecules, 2012, 13(5):1515-1522.doi: 10.1021/bm300201x.

[9] Ulbrich K, Knobloch T, Kreuter J.Targeting the insulin receptor: nanoparticles for drug delivery across the blood-brain barrier (BBB)[J].J Drug Target, 2011, 19(2):125-132.doi: 10.3109/106118610037 34001.

[10 Tosi G, Costantino L, Ruozi B, et al.Polymeric nanoparticles for the drug delivery to the central nervous system[J].Expert Opin Drug De?liv, 2008, 5(2):155-174.doi: 10.1517/17425247.5.2.155.

[11] Kreuter J.Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: what do we know[J]? Adv Drug Deliv Rev, 2014, 71: 2-14.doi:10.1016/j.addr.2013.08.008.

[12] Li J, Cai P, Shalviri A, et al.Amultifunctional polymeric nanother?anostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brainmetastases of breast cancer[J].ACS Nano, 2014,8(10):9925-9940.doi: 10.1021/nn501069c.

[13] Steiniger SC, Kreuter J, Khalansky AS, et al.Chemotherapy of glio?blastoma in rats using doxorubicin- loaded nanoparticles[J].Int J Cancer, 2004, 109(5):759-767.doi: 10.1002/ijc.20048.

（2015-08-14收稿2015-09-11修回）

（本文編輯陳麗潔）

Synthesis of acid-sensitive doxorubicin prodrug nanoparticle and its application in brain glioma treatment

LIU Jinjian#, ZHANG Yumin#, YANG Cuihong, CHU Liping ,hUANG Fan, GAOhonglin, LIU Jianfeng△
Tianjin Key Laboratory of Radiationmedicine andmolecular Nuclearmedicine, Institute of Radiationmedicine, Chinese Academy ofmedical Science and Peking Unionmedical College, Tianjin 300192, China
△Corresponding Author E-mail:lewis78@163.com

Abstract:Objective To synthesize a new kind of acid-sensitive doxorubicin prodrug nanoparticles and to evaluate its anti-brain glioma effect and efficiency through blood-brain barrier (BBB).Methods The prodrug acid-sensitive poly?ethylene glycol (PEG) - doxorubicin (PEG-DOX) copolymer was synthesized by Schiff base reaction, and PEG-DOX pro?drug nanoparticles (PEG-DOX NPs) were prepared by self-assembling.The character of PEG-DOX copolymer was detected by dynamic light scattering (DLS) instrument and1H NMR.Themorphology of PEG-DOX NPs was observed by transmission electronmicroscopy (TEM).The character of drug release was detected by UVmothed.The cellular uptake efficiency of glio?ma cells to PEG-DOX NPs was observed by inverted fluorescencemicroscope.The anti-brain glioma effects of PEG-DOX NPs and Free DOX were studied bymTTmothed.PS80-PEG-DOX NPs were gained by themodification of PEG-DOX NPs with Tween 80.Nine BALB/cmice were separated into Free DOX, PEG-DOX NPs and PS80-PEG-DOX NPs groups by ran?dom drawing lots.Themean fluorescence intensity of brain andmain organs were observed by in vivo imaging system.Re?sults The copolymer of PEG-DOX can self-assemble into nanoparticles with the diameter of 100 nm.PEG-DOX NPs can quickly release DOX in acid environment.Although PEG-DOX NPshad slow cancer cell uptake than Free DOX, ithad lon?book=34,ebook=39ger accumulation.MTT results showed that PEG-DOX NPshad concentration dependent anti-brain glioma effect.Indepen?dent samples t-test indicated that the efficiency through BBB was significantlyhigher in PS80-PEG-DOX NPs group than that of Free DOX group and PEG-DOX NPs group.Conclusion PEG-DOX NPs show well anti-brain glioma effect in vi?tro, and can across BBB withhigh efficiency aftermodification, whichmake it possible for a potential therapeutic prodrug for brain glioma.

Key words:blood-brain barrier; doxorubicin prodrug; nanoparticle; brain glioma; acid-sensitive

通訊作者△E-mail: lewis78@163.com

作者簡介：劉金劍（1981），男，助理研究員，主要從事自組裝納米材料、分子核醫學研究

基金項目：國家自然科學基金資助項目（51203189，51303213，81171371）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（13JCZD?JC28100）；“協和青年基金資助”和“中央高校基本科研業務費專項資金資助”（3332015100）；中國醫學科學院放射醫學研究所發展基金（1550，1428）

中圖分類號：R318.08

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150109

作者單位：中國醫學科學院&北京協和醫學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室（郵編300192）