慢性低氧肺動脈高壓大鼠肺部PPARγ表達變化的意義

向光明，劉焰

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慢性低氧肺動脈高壓大鼠肺部PPARγ表達變化的意義

向光明1,2，劉焰1△

摘要：目的探討過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）在慢性低氧肺動脈高壓（HPAH）大鼠模型肺部及血管中的變化及意義。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為正常（NC）組、1周低氧（HC-1w）組、2周低氧（HC-2w）組、3周低氧（HC-3w）組。NC組于常氧條件下飼養于通風動物籠中3周，其余低氧組動物在每日9：00—17：00（8h/d）放入一體化低氧艙（O2體積分數10%）中進行低氧處理，時間分別為1周、2周、3周。右心導管法檢測平均肺動脈壓（mPAP），右心室收縮期末壓力（RVSP）；解剖心臟計算右心室肥厚指數RV/(LV+S)。HE染色觀察各組肺部中小動脈的形態學改變，計算血管壁厚百分比（WT%），Western blot方法檢測肺組織中PPARγ蛋白表達水平。結果HC各組大鼠mPAP、RVSP、RV/(LV+S)血流動力學指標均較NC組明顯升高（P < 0.05）。血管形態學顯示HC各組相對于NC組，血管壁明顯增厚，血管腔變狹窄，且隨著時間延長，狹窄和增厚的程度加深。PPARγ在HC各組的表達與NC組相比均呈明顯下降趨勢，且隨著時間延長，下降趨勢更加明顯。結論PPARγ對慢性低氧肺動脈高壓的發生和發展有著重要的意義。

關鍵詞：高血壓,肺性；缺氧；過氧化物酶增殖物激活受體γ；大鼠, Sprague-Dawley；低氧性肺動脈高壓

因此，PPARγ可能在呼吸系統生理和呼吸系統疾病中扮演重要的角色。本研究觀察PPARγ在慢性低氧肺動脈高壓大鼠肺部表達變化，嘗試闡述其病理機制。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠40只，200～250 g，由三峽大學醫學院實驗動物中心提供。低氧艙（OxyCyclermodel A84XOV，美國Biospherix公司），Nikon&Spot圖像采集處理系統（日本Nikon公司），RM-6280多道智能生理信號記錄系統（成都儀器廠），兔抗大鼠PPARγ多克隆抗體、兔抗大鼠βactin多克隆抗體、山羊抗兔多克隆抗體（美國genetex公司），DAB顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠HPAH模型的建立將40只大鼠按隨機數字表法分為4組，每組10只：正常組（NC），1周低氧（HC-1w）組，2周低氧（HC-2w）組，3周低氧（HC-3w）組。HC各組每天9:00—17:00（8h/d）進入一體化低氧艙（O2體積分數10%）中進行低氧造模處理，正常組飼養于通風常氧動物籠內。在造模期間，各組大鼠均給予充足的食物和水自由攝取。

1.2.2血流動力學測定在1周末、2周末分別檢測HC-1w組、HC-2w組大鼠血流動力學，3周末檢測HC-3w組和NC組大鼠血流動力學。將大鼠做頸部正中切口，分離皮下組織及肌肉后暴露出右頸外靜脈，使用一直徑1mm聚乙烯塑料微導管內裝肝素溶液（生理鹽水＋肝素10 U/mL）緩慢進入其中，另外一端連接壓力感受器。注意生理記錄儀壓力波形變化及導管進入深度，判斷導管前端位置。導管途經上腔靜脈依次進入右心房、三尖瓣口、右心室，直至肺動脈干，長度大約進入3.5～4.0 cm。待波形穩定3～5min后測量平均肺動脈壓（mPAP）及右心室收縮期末壓力（RVSP）。記錄完畢后，處死大鼠，剪取心臟，剪去心房組織，分離出右心室（RV）和左心室+室間隔（LV+S）后濾紙吸干，稱RV和LV+S質量，計算右心室肥厚指數RV/（LV+S）。

1.2.3肺動脈形態學指標觀察剪取右肺組織塊，甲醛固定，石蠟包埋、連續切片及HE染色，選取顯色較好，彈力層清晰的直徑小于150 μm中小肺動脈(15 μm＜管徑＜150 μm)。于400倍光鏡下觀察形態變化。圖像采集處理系統分析計算血管壁厚百分比（WT%），公式：（外彈力膜直徑－內彈力膜直徑）/外彈力膜直徑×100%。獲取的大鼠動脈圖片采用隨機數字表法隨機分組，每組大鼠測量8～10個中型肺動脈及小型肺動脈取其均值。

1.2.4蛋白印跡檢測PPARγ的表達變化冰上勻漿肺部組織塊，加裂解液后4℃條件下12 000 r/min離心取上清分裝，BCA蛋白含量測試盒測定各組細胞總蛋白濃度。各組上樣30 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳2h后轉PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1h，加入1∶400稀釋兔抗大鼠β-actin，1∶200稀釋兔抗大鼠PPARγ，4℃孵育過夜后TBST溶液洗滌10min×3次，1∶5 000稀釋山羊抗兔二抗，室溫孵育2h TBST液洗滌10min×3次。利用化學發光ECL試劑顯影，并曝光掃描拍照，用Quantity One軟件分析各組條帶中PPARγ蛋白的相對表達，分析其與內參蛋白β-actin的比值。

1.3統計學方法采用sigma plot軟件進行統計學分析。計量數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-q法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組血流動力學指標比較NC組、HC-1w組、HC-2w組、HC-3w組的mPAP、RVSP和RV/(LV+S)依次增高，組間比較差異均有統計學意義（均P< 0.05），見表1。

Tab.1　Comparison ofmPAP, RVSP and index of right ventricularhypertrophy between four groups表1　各組mPAP、RVSP和右心肥厚指數比較（n=10,±s）

Tab.1　Comparison ofmPAP, RVSP and index of right ventricularhypertrophy between four groups表1　各組mPAP、RVSP和右心肥厚指數比較（n=10,±s）

＊P < 0.05，＊＊P < 0.01；a與NC組比較，b與HC-1w組比較，c與HC-2w組比較，P < 0.05；表2同；1mmHg=0.133 kPa

NC組HC-1w組HC-2w組HC-3w組F 16.4±3.1 20.1±2.8a27.4±3.3ab39.1±2.4abc117.415＊＊28.8±2.0 32.9±1.9a39.3±4.5ab47.3±3.8abc61.594＊＊24.1±4.3 29.7±2.9a33.8±4.5ab38.7±3.4abc26.141＊＊

2.2肺動脈形態學指標的變化NC組小動脈血管內膜光滑完整，血管壁不厚，肌層無明顯增厚，外膜無增生及纖維化表現。HC-1w組血管內膜開始不光整，血管壁稍增厚，肌層及外膜輕微增生及纖維化。HC-2w較HC-1w組血管重塑程度加深。HC-3w組血管明顯重塑，內膜不光滑，管壁增厚，管腔狹窄，肌層及外膜增生明顯，纖維化嚴重。NC組、HC-1w組、HC-2w組、HC-3w組的WT%依次增高，組間比較差異均有統計學意義（均P<0.05）見圖1、表2。

Fig.1　Pulmonary arterymorphological changes in four groups of rats圖1　各組大鼠肺動脈形態學變化（HE染色，×400）

Tab.2　Comparison of WT% and PPARγ expression between four groups表2　各組WT%和PPARγ蛋白表達比較（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of WT% and PPARγ expression between four groups表2　各組WT%和PPARγ蛋白表達比較（n=10，±s）

組別NC組HC-1w組HC-2w組HC-3w組F WT% 8.8±0.4 11.6±2.5a13.7±2.7ab15.8±2.2abc19.293＊PPARγ 0.84±0.05 0.71±0.09a0.54±0.08ab0.23±0.04abc34.341＊

2.3各組PPARγ的表達變化比較NC組、HC-1w組、HC-2w組、HC-3w組的PPARγ表達依次降低，且隨著時間延長，降低趨勢更加明顯，組間比較差異均有統計學意義，見表2、圖2。

Fig.2　Expression of PPARγ protein in four groups圖2　各組PPARγ蛋白表達

3　討論

肺動脈高壓（pulmonary arterialhypertension, PAH）并非一個單獨的疾病，而是多種原因誘發引起的一類綜合征，發病機制尚未完全明確。HPAH在肺動脈高壓分類中屬第三大類，HPAH的病理變化首先是異常的肺血管收縮（hypoxic pulmonary vaso?constriction,HPV），主要是在低氧環境中肺部血管不規則痙攣[4]，但是間斷甚至持續的HPV無疑會極大加重右心負荷[5]，促進產生肺血管重塑（pulmonary ar?tery remodeling,PAR）。持續的低氧造成血管內皮的損傷，各種生長因子和血管活性物質分泌失調，外加血流動力學紊亂對血管的物理性沖擊，肺動脈各層可出現異常細胞增殖凋亡及遷移現象[6-7]。肺中小血管處于缺氧環境加重HPV，反過來HPV加重PAR進一步加重缺氧，造成惡性循環，直至右心衰竭乃至全心衰竭，機體死亡[8-9]。

既往研究證明PPARγ在血管的重塑和增加血管通透性方面有重要作用[10]。PPARγ受體激動劑通過PI3K/Akt/NO信號通路可顯著改善血管內皮依賴性舒張功能。PPARγ的天然配體或者人工合成配體都可與內皮上的PPARγ結合，PPARγ一旦被激活，可抑制一氧化氮合成酶[11]、清道夫受體A基因和血栓素合成酶基因轉錄與表達，阻止血管內皮細胞的增殖、遷移，減弱內皮素的分泌，從一定程度上弱化血管重塑[12]。PPARγ還可以對單核細胞趨化蛋白（MCP-l）及其受體CCRZ的轉錄進行抑制，減緩巨噬細胞向血管炎癥部位聚集。同時抑制白細胞介素（IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子（TNF）-α等炎癥因子，全面減輕血管損傷后的炎癥反應[13]。PPARγ標志性激動劑羅格列酮已經在PAH動物實驗中運用，證實對HPAH有一定積極療效，且PPARγ阻斷劑GW9662可顯著阻斷羅格列酮的作用，為HPAH的臨床防治提供了新的思路[14]。本實驗發現，隨著低氧時間延長，大鼠肺部PPARγ表達下降，提示PPARγ在HPAH動物模型中的表達和低氧密切相關，PPARγ的表達可能是HPAH新的治療靶點。但是PPARγ如何具體地在低氧肺血管重塑中發揮作用，離體實驗是否有同樣趨勢，都是以后值得深入研究的問題。

參考文獻

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（2015-06-07收稿2015-08-17修回）

（本文編輯李國琪）

The significance of PPARγ expression in lung tissue of rats withhypoxic pulmonaryhypertension

XIANG Guangming1,2, LIU Yan1△
1 Basicmedical College, Wuhan University, Wuhan 430071, China; 2 Institute of Respiratory Disease, China Three Gorges University, Yichang Central People′shospital△Corresponding Author E-mail:liuyan@whu.edu.cn

Abstract:Objective To investigate the significance of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ expression in the lung tissue of rats with chronichypoxic pulmonaryhypertension (HPAH).Methods Fortymale Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=10 for each group): normal control group (NC),hypoxia control group-one-week (HC-1w),hypoxia control group-two-week (HC-2w) andhypoxia control group-three-week (HC-3w).Normal control group was raised under normal oxygen condition in ventilated animal cage for three weeks.The otherhC groups were placed in a low oxygen chamber (O2concentration of 10%) from 9：00 AM-5:00 PM (8h/d) everyday by one week, two weeks and three weeks.Themean pulmonary arterial pressure (mPAP), right ventricular systolic pressure (RVSP) were detected.The index of right ventricularhypertrophy RV/(LV+S) wasmeasured by dissecting ratheart.Themorphological changes of the small pul?monary arteries were observed byhE staining, and the percentage of vascular wall thickness (WT%) was calculated.The ex?pression level of PPARγ protein was detected by Westren blot assay.Results ThemPAP, RVSP and RV/(LV+S) were sig?nificantlyhigher inhC groups than those of NC group (P<0.05).Themorphology of pulmonary arteries showed vessel wall thickening and vessel lumina stenosis inhC groups compared with that of NC group.The PPARγ expression in lung tissue was significantly lower inhC groups than that of NC group, and the downward trend wasmore obvious with the extension of time.Conclusion PPARγ plays an important role in the occurrence and development of chronichypoxic pulmonaryhyper?tension.

Key words:hypertension, pulmonary; anoxia; PPAR gamma; rats, Sprague-Dawley;hypoxic pulmonary arteryhyper?tensionbook=57,ebook=62低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary arteryhy?pertension,HPAH）主要病因為高原疾病或肺部疾病誘發的慢性持續缺氧狀態。近年來，隨著空氣污染及霧霾的嚴重，肺部基礎疾病如慢性阻塞性肺疾病（COPD）等繼發性缺氧疾病明顯增加，HPAH發病率和死亡率有所上升。HPAH患者療效差，成為呼吸內科的臨床難點問題之一[1]。過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）是一類包含PPAR-α、β/δ和γ 3種亞型的核轉錄因子超家族，為異質二聚體，其隸屬于維甲酸X受體[2]。PPARγ在呼吸道上皮、呼吸道平滑肌、肺部血管內皮及支氣管黏膜下層均有不同程度的表達。PPARγ可抑制血管平滑肌增殖，影響血管內皮功能及內皮素-1（endothelin-1,ET-1）分泌[3]。

通訊作者△E-mail：liuyan@whu.edu.cn

作者簡介：向光明（1968），男，副主任醫師，主要從事呼吸衰竭研究

基金項目：湖北省自然科學基金指導性計劃項目（2014CFC1037）

中圖分類號：R563

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59062

作者單位：1武漢大學基礎醫學院（郵編430071）；2三峽大學呼吸病研究所，宜昌市中心人民醫院