抗衰片對電離輻射損傷后小鼠骨髓造血作用的影響

康肖夢，王華偉，杜利清，趙潔，張宇睿，王華南，楊福軍，徐文清

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抗衰片對電離輻射損傷后小鼠骨髓造血作用的影響

康肖夢，王華偉，杜利清，趙潔，張宇睿，王華南，楊福軍Δ，徐文清Δ

摘要：目的探討抗衰片對電離輻射損傷后小鼠造血重建的調控影響。方法9～10周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為照射對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。后3個劑量組分別按0.75、1.5、3.0 g/kg體質量灌服抗衰片水溶液，照射對照組給予同體積生理鹽水，1次/d，連續給藥11 d。第4天對4組小鼠進行6.0 Gy137Cs-γ射線單次全身照射。照射后第8天，觀察小鼠內源性脾結節（即脾集落形成單位，CFU-S）、小鼠骨髓粒-巨噬細胞集落形成單位（CFU-GM）和骨髓成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）的生成情況。同時，體外擴增的骨髓間充質干細胞（MSC）與正常供體小鼠的造血干細胞（HSC）進行二維共培養（2D CFU-GM），通過2D CFU-GM檢測輻射損傷后藥物作用的MSC促進HSC的增殖能力。結果與照射對照組相比，3個劑量組的CFU-GM數目顯著增多，中劑量組及高劑量組CFU-S、CFU-F、2D CFU-GM增殖能力顯著提高（均P＜0.05）。結論抗衰片可以促進電離輻射損傷后小鼠造血系統重建。

關鍵詞：抗衰片；輻射損傷；造血重建；間質干細胞；造血干細胞

電離輻射可對機體造成一系列嚴重損傷，包括免疫系統、造血系統、消化系統等，其中以骨髓造血系統最為敏感[1]。輻射損傷后造血系統功能恢復在輻射損傷的救治中處于核心地位。因此，尋找調控造血恢復的有效手段以提高輻射損傷的救治效果，對輻射損傷或意外照射患者的救治十分重要。

中醫認為，射線是“火熱毒邪”，作用人體會導致熱毒過盛、津液受損，進而灼津爍血、傷陰耗氣，導致氣血損傷、脾胃失調、肝腎虧損等。因此，應該以清熱解毒、養陰生津、健脾和胃、滋補肝腎等作為輻射損傷的治療原則。中藥復方抗衰片具有健脾益腎、滌痰降濁、活血散結的功效。此方中丹參活血通絡；桑寄生、淫羊藿、何首烏、杜仲調補肝腎、益精填髓；茯苓、菖蒲祛痰開竅；龜甲益腎強骨、養血補心；黨參補中益氣、健脾益肺[2-3]。全方可調和陰陽，扶正祛邪，填精補髓，強身健腦。因此，本研究以抗衰片作為藥物干預手段，探討輻射損傷后通過改善造血微環境，進而調控造血重建作用，為臨床輻射損傷的救治尤其是放療后造血系統損傷的恢復提供借鑒作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器實驗動物：SPF級9～10周齡雄性C57BL/6小鼠40只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。于中國醫學科學院放射醫學研究所SPF級動物實驗中心飼養，溫度（23±1）℃，相對濕度55%±5%，壓力差≤10 Pa，每日光照12h，自由攝食飲水。主要材料：生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液；中國大冢制藥有限公司）；MesenCult?MSC Basalmedium（Mouse；STEMCELL TECHNOLOGIES公司，產品號：05501）；MesenCult?MSC Stimulatory Supplements（Mouse；STEMCELL公司，產品號：05502）；DMEM培養基（Gibco公司）；IMDM培養基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，HyClone公司）；甲基纖維素半固體培養基（STEMCELL公司）；胰蛋白酶（Invitrogen公司）。主要儀器：超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD）；CO2培養箱（NAP? COmODEL 5410）；倒置顯微鏡（OLYMPUS IM）；137Cs-γ射線照射源（加拿大原子能有限公司，Gammacel 40）。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與給藥將40只小鼠按照隨機數字表法分為照射對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。3個給藥組分別按0.75、1.5、3.0 g/kg灌服抗衰片水溶液，照射對照組給予同體積生理鹽水，1次/d，連續灌胃11 d。第4天對4組小鼠進行6.0 Gy137Cs-γ射線單次全身照射，劑量率1 Gy/min。照后繼續給藥7 d。

1.2.2脾結節（即脾集落形成單位，CFU-S）計數照后第8天，處死小鼠。取脾臟，Bouin氏液固定，計數其表面突起的CFU-S。

1.2.3骨髓間充質干細胞（MSC）獲得與培養無菌條件下，取小鼠雙側股骨和脛骨，剔除表面肌肉和結締組織，用含2% FBS的IMDM沖出骨髓，制成單細胞懸液，計數，400×g離心1min，MSC培養基重懸細胞，于25 cm2培養瓶中37℃、5% CO2飽和濕度培養箱內進行培養。

1.2.4骨髓粒-巨噬細胞集落形成單位（CFU-GM）計數調整骨髓細胞濃度至5×104個/mL，將細胞液加入到甲基纖維素半固體培養基中，渦旋混勻后接種至12孔板中培養，每組設3個平行孔，第8～12天觀察、計數。

1.2.5骨髓成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）計數用MSC培養基調整骨髓細胞濃度至5×106個/mL，接種至6孔板，每組設3個平行孔，第7～8天觀察。

1.2.6MSC支持HSC增殖的二維共培養研究（2D CFUGM）取第2代MSC，調整細胞濃度至1.5×105個/mL，接種至6孔板。24h細胞貼壁后，吸去MSC培養基，每孔加入1× 105個/mL正常C57BL/6供體小鼠骨髓細胞，每組設3個平行孔，第10天左右觀察。

1.3統計學方法應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1CFU-S檢測結果與照射對照組和低劑量組相比，中、高劑量組的脾結節數目均顯著升高（P＜0.05）。說明抗衰片對受照小鼠髓外造血功能有促進作用，見圖1。

Fig.1　Effects of KS tablet on CFU-S ofmice treated with137Cs-γ ray圖1　抗衰片對137Cs-γ射線損傷小鼠脾結節的影響

2.2CFU-GM檢測結果與照射對照組相比，3個劑量組的CFU-GM增殖能力顯著提高，且高劑量組的CFU-GM增殖能力顯著高于低劑量組（P＜0.05）。說明抗衰片對受照小鼠HSC增殖能力的提高有促進作用，見圖2。

Fig.2　Effects of KS tablet on CFU-GM in four groups圖2　抗衰片對各組CFU-GM的影響

2.3CFU-F檢測結果與照射對照組相比，中、高劑量組的CFU-F增殖能力均有顯著提高，且中劑量組高于低、高劑量組（P＜0.05）。說明抗衰片對受照小鼠MSC具有促進作用，見圖3。

Fig.3　Influence of KS tablet on CFU-F ofmSC in four groups圖3　抗衰片對各組間充質干細胞CFU-F的影響

2.4MSC與HSC共培養2D CFU-GM的結果與照射對照組相比，中、高劑量組的2D CFU-GM增殖能力提高（P＜0.05）。3個劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

Fig.4　Influence of KS tablet onhSC functions supported bymSC （2D CFU-GM）圖4　抗衰片對MSC支持HSC功能（2D CFU-GM）的影響

3　討論

電離輻射會對機體的造血系統、免疫系統、消化系統等造成嚴重損傷，其中尤以骨髓造血系統最為敏感。射線對HSC產生殺傷同時，也對骨髓造血微環境造成損傷[4]。目前的研究多側重于HSC的調控方面，而對HSC依賴的造血微環境研究較少。

正常造血功能依賴于造血干細胞與骨髓造血微環境之間的相互作用[5]。近年來越來越多的細胞和分子水平實驗證實，造血干細胞在造血微環境各因素的調控下進行增殖、分化、發育和成熟。骨髓造血微環境主要由基質細胞、細胞外基質以及基質細胞所分泌的細胞因子構成。基質細胞包括血管內皮細胞、間充質干細胞、成骨細胞、巨噬細胞等多種非造血細胞。位于血管內皮附近的MSC作為造血微環境的重要組成之一[6]，一方面特異性分化為成骨細胞、脂肪細胞等基質細胞[7]，另一方面維持造血干細胞功能[8]。研究證實，MSC通過其表面的黏附分子以及分泌多種細胞因子來維持HSC功能，如干細胞因子（SCF）、基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、白細胞介素（IL）等[9-10]。

本實驗對接受亞致死劑量γ射線照射的小鼠給予具有健脾益腎、滌痰降濁、活血散結功效的中藥復方抗衰片，以期達到調控造血微環境進而調控HSC功能之效。結果顯示小鼠接受射線照射后，骨髓HSC及造血微環境均受損，脾臟出現結節狀造血灶，即內源性脾結節（CFU-S）。脾結節反映了HSC的功能，代表機體造血功能恢復的能力[11]。本次實驗研究發現，中、高劑量組小鼠脾結節數均高于照射對照組，提示抗衰片能夠促進髓外脾臟造血功能，促進造血恢復。CFU-GM反映了HSC自我更新能力的大小。本次實驗結果顯示，3個劑量組的CFU-GM數目均顯著大于照射對照組，說明抗衰片可以促進機體造血功能的恢復。骨髓MSC經體外培養可以形成CFU-F，而MSC為分泌造血因子的主要細胞成分，說明CFU-F在一定程度上可以間接反映機體造血微環境的情況[12-13]。本研究的中、高劑量組CFUF集落形成能力顯著高于照射對照組，提示抗衰片能促進基質細胞MSC的增殖能力，對改善造血微環境起到一定的作用。上述實驗結果并不能直接證實抗衰片是通過調控造血微環境的功能，從而調控HSC增殖的作用。為此本課題組進行了MSC與HSC體外共培養實驗（2D CFU-GM）。實驗結果表明，中、高劑量組2D CFU-GM增殖能力顯著高于照射對照組，提示抗衰片可能是通過增強MSC功能從而改善造血微環境，進而促進HSC功能的恢復。

綜上所述，抗衰片可以通過增強輻射損傷后造血微環境中基質細胞MSC功能，改善造血微環境，進而調控HSC功能，重建造血功能。其中，中劑量組效果比較顯著。抗衰片調控造血微環境進而調控造血功能的具體作用機制目前尚未闡述清楚，因此后續研究需要進一步從分子水平進行探討。

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（2015-09-02收稿2015-11-05修回）

（本文編輯李鵬）

The effects of KS tablet onhematopoietic regulation inmice treated with radiation

KANG Xiaomeng, WANGhuawei, DU Liqing, ZHAO Jie, ZHANG Yurui, WANGhua′nan, YANG FujunΔ, XU WenqingΔ
Institute of Radiationmedicine, Chinese Academy ofmedical Science & Peking Unionmedical College, Tianjin 300192, China
△Corresponding Author E-mail：fjyang32@126.com; xuwenqing@irm-cams.ac.cn

Abstract：Objective To investigate the effects of Kangshuai (KS) tablet on thehematopoietic reconstitution inmice treated with radiation.Methods C57BL/6mice were randomly divided into four groups: irradiated control group, low-dosebook=60,ebook=65group (0.75 g/kg),middle-dose group (1.5 g/kg) andhigh-dose group (3.0 g/kg).There were tenmice for each group.Themice in three treated groups were given KS tablet suspension orally for three days before the treatment with irradiation, and the control group was given equal quantity of normal saline.All themice were underwent irradiation of 6.0 Gy137Cs-γ rays, and were continuously given drug suspension or saline for seven days.Themice were sacrificed on the eighth day after irradiation.Colony forming unit of spleen (CSF-S), granulocytemacrophage colony-forming unit (CFU-GM) and fibroblast colony-form?ing unit (CFU-F).The 2D CFU-GMhematopoietic stem cells (HSC) were co-cultured withmesenchymal stem cell (MSC).Re?sults Compared with the irradiated control group, numbers of CFU-GM were significantly increased in three treatment groups.The proliferations of CFU-S, CFU-F and 2D CFU-GM were significantly enhanced inmiddle andhigh dose groups (P＜0.05).Conclusion KS tablet can promotehematopoietic reconstitution inmice after irradiation damage.

Key words：BSKS tablet；radiation injuries；hematopoietic reconstitution；mesenchymal stem cells；hematopoietic stem cells

通訊作者ΔE-mail：fjyang32@126.com；xuwenqing@irm-cams.ac.cn

作者簡介：康肖夢（1989），女，碩士在讀，主要從事造血系統輻射損傷防治研究

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81273005）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（14JCZDJC36400）；中國醫學科學院放射醫學研究所所基金（SF1528，SF1533，ST1552）

中圖分類號：R285.5，R818.74

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150143

作者單位：北京協和醫學院；中國醫學科學院放射醫學研究所（郵編300192）