NKG2D-IL-21融合基因修飾的結腸癌細胞體外刺激NK細胞活化的研究

趙培蕾, 趙藝杰, 冷　潔, 龔衛娟

(揚州大學醫學院 免疫學教研室, 江蘇 揚州, 225001)

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NKG2D-IL-21融合基因修飾的結腸癌細胞體外刺激NK細胞活化的研究

趙培蕾, 趙藝杰, 冷潔, 龔衛娟

(揚州大學醫學院 免疫學教研室, 江蘇 揚州, 225001)

摘要:目的觀察含NKG2D-IL-21融合基因的重組表達載體轉染結腸癌細胞后對NK細胞活化的影響。方法首先利用DNA限制性內切酶鑒定插入真核表達載體(pcDNA3.1-NKG2D-IL-21)的NKG2D和IL-21基因序列，并通過脂質體介導質粒轉染結腸癌細胞株CT-26。流式細胞術胞內染色法檢測CT-26內NKG2D-IL-21融合蛋白的表達，酶聯免疫吸附實驗鑒定細胞培養上清NKG2D-IL-21蛋白的含量。最后將經基因轉染的CT-26細胞與小鼠脾臟NK細胞共培養，流式細胞術檢測NK細胞表面活化性受體CD69的表達。結果NKG2D-IL-21融合基因穩定插入pcDNA3.1載體。CT-26細胞經外源性NKG2D-IL-21融合基因轉染后，表達含有NKG2D和IL-21的融合蛋白。分泌NKG2D-IL-21融合蛋白的CT-26細胞具有明顯促進NK細胞表達CD69的活性。結論重組pcDNA3.1-NKG2D-IL-21真核表達載體可作為一種新型DNA疫苗。

關鍵詞:NKG2D; IL-21; 融合基因; 結腸癌; NK細胞

NKG2D是表達于NK、CD8+T、γδT、NKT細胞表面的一種活化性受體。當NKG2D與其受體結合, 可激活與其偶聯的信號轉接蛋白DAP10, 從而啟動細胞活化信號通路，促進這些淋巴細胞分泌IFN-γ等細胞因子，以及發揮細胞毒性功能[1-2]。NKG2D的配體為主要表達于人腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合體 I類相關抗原A和B(MICA、MICB), 小鼠主要為視黃酸早期誘導轉錄子(RAE-1)[3-4]。由于免疫選擇壓力，晚期腫瘤患者體內淋巴細胞表面NKG2D的表達明顯降低，從而不能介導NK細胞等的免疫監視作用[5-6]。IL-21主要由活化的T細胞和NK細胞分泌，IL-21與其受體結合后，激活胞內的JAK1、JAK3和STAT3激酶，從而促進淋巴細胞分泌顆粒酶、IFN-γ，顯著增強淋巴細胞的殺傷功能[7-8]。本研究觀察課題組前期制備的含NKG2D和IL-21融合基因的表達載體(pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21)轉染結腸癌細胞后，是否具有激活NK細胞的功能，從而為制備含該重組表達載體的抗腫瘤基因疫苗提供重要實驗依據。

揚州市-揚州大學合作基金(2012038-5); 國家級大學生創新創業訓練計劃(2013111117045Z)

1材料與方法

1.1實驗材料

重組真核表達載體pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21為本課題組前期制備并常規保存，脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。DNA限制性內切酶購自Takara公司，質粒抽提試劑盒來自Qiagen公司。小鼠NKG2D抗體(CX5)、CD49b抗體(DX5)、CD69抗體(H1.2F3)，流式胞內染色破膜試劑盒、IL-21檢測ELISA試劑盒購自eBioscience公司。重組小鼠IL-21蛋白來自Peprotec公司，RPMI-1640培養基購自Invitrogen 公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。CT-26細胞株來自美國ATCC公司，Balb/c小鼠來自揚州大學比較醫學中心。

1.2方法

1.2.1雙酶切鑒定重組載體pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21: 含重組質粒的細菌經過夜培養后，利用Qiagen公司小量質粒提取試劑盒，按說明書抽提質粒，紫外分光光度計法測定質粒的濃度。在20 μL總體系中，分別加入Xba I和Kpn I、Xba I和Xho I、Xho I和Kpn I DNA限制性內切酶，37 ℃孵育4 h, 進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2脂質體包裹質粒后轉染細胞：調整重組DNA質粒的濃度為 1 mg/mL, 與脂質體按質量/體積比為6︰1室溫孵育20 min。同時對隔夜接種的CT-26細胞(小鼠結腸癌細胞株)用無血清培養基洗滌3次，加入脂質體質?；旌衔?，37 ℃孵育5 h后，更換為全血清培養基。72 h后同時收集細胞和培養上清。

1.2.3流式細胞術胞內染色法檢測融合蛋白：收集經脂質體轉染的CT-26細胞，經冷PBS洗滌后，加入固定/破膜劑，室溫孵育30 min收集細胞，破膜緩沖液洗滌細胞，加入以破膜緩沖液稀釋的NKG2D抗體(10 μg/mL)，4 ℃孵育30 min, 破膜緩沖液洗滌3次后，利用流式細胞儀(FACS Calibur)檢測陽性細胞的頻率。

1.2.4ELISA檢測細胞培養上清融合蛋白：取預先包被好抗體的酶標板，分別加入上述經脂質體轉染的細胞培養上清，37 ℃孵育30 min, 洗滌后加入酶標抗體和底物，37℃避光孵育1 h，加入終止液。15 min后利用酶標儀讀取450 nm處吸光度值。根據陽性蛋白對照繪制標準曲線，計算各樣品內NKG2D-IL-21的濃度。

1.2.5基因修飾的CT-26細胞對NK細胞的刺激：按1.2.2方法轉染CT-26細胞，48 h后分離正常小鼠脾臟單細胞懸液，按1︰1細胞數比例共培養過夜。次日收集細胞，經冷PBS洗滌后，同時加入CD49b抗體(DX5，標記小鼠NK細胞)和CD69抗體，流式細胞儀檢測DX5+CD69+細胞的頻率。

1.3統計學分析

不同處理組之間的差異采取ANOVA分析方法，兩組之間的比較采取團體t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1重組pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21表達載體

的酶切鑒定

為明確課題組先前制備的2個NKG2D胞外區和IL-21基因序列均插入真核表達載體pcDNA3.1(-)，分別利用Xba I和Kpn I、Xba I和Xho I、Xho I和Kpn I DNA限制性內切酶處理重組載體。結果證實，在Xba I和Xho I酶切位點之間插入了第1個NKG2D基因序列(544 bp)，在Xho I和Kpn I酶切位點之間插入了第2個NKG2D和IL-21基因序列(858 bp)，而在Xba I和Kpn I酶切位點之間則包含了2個NKG2D和IL-21的基因序列(1402 bp)，其電泳結果見圖1。

2.2重組質粒轉染CT-26細胞后融合蛋白表達的鑒定

脂質體包裹重組質粒后，體外轉染對數期培養的CT-26細胞，72 h后收集細胞，流式細胞儀胞內染色法檢測NKG2D-IL-21融合蛋白的表達。結果證實，重組質粒轉染細胞后，NKG2D-IL-21融合蛋白得到表達(圖2)，且隨著轉染質粒濃度的增加，NKG2D-IL-21融合蛋白陽性表達的細胞頻率明顯增高(圖3)。

1.pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21載體經XbaI和KpnI酶切2.pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21載體經XhoI和KpnI酶切3.pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21載體經XbaI和XhoI酶切4.DNAladder圖1 重組載體pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21雙酶切后產物的凝膠電泳結果

圖2 流式細胞儀胞內染色法檢測CT-26細胞表達的融合蛋白NKG2D-IL-21

與空質粒相比,**P<0.01;與空質粒相比,***P<0.001。圖3 不同劑量重組質粒轉染CT-26細胞后,NKG2D陽性細胞頻率的比較

2.3重組質粒轉染CT-26細胞，培養上清內融合蛋白濃度的測定

收集經重組質粒轉染的細胞培養上清，ELISA檢測上清內IL-21的濃度。結果顯示，重組質粒轉染細胞后，NKG2D-IL-21融合蛋白可分泌細胞外，且隨著轉染質粒濃度的增加，NKG2D-IL-21融合蛋白陽性表達的細胞頻率明顯增高(圖4)。

與空質粒相比,*P<0.05;與空質粒相比,**P<0.01。圖4 不同劑量重組質粒轉染CT-26細胞后,培養上清NKG2D-IL-21融合蛋白的濃度

2.4重組質粒轉染的CT-26細胞對NK細胞的刺激

CT-26細胞經重組質粒轉染后，與脾臟單細胞懸液孵育后，檢測NK細胞表面CD69的表達。結果發現，與商品化重組IL-21蛋白相似，經重組質粒轉染的CT-26細胞可明顯促進NK細胞表達CD69(圖5、6)。

圖5 重組質粒轉染CT-26細胞后,刺激NK細胞表達CD69的檢測

與空質粒相比,**P<0.01。圖6 經重組質粒轉染的CT-26細胞刺激NK細胞表達CD69的統計學分析

3討論

本研究首先對課題組先前制備的重組pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21載體進行表達特性分析，在證實該重組載體轉染結腸癌CT-26細胞后，可在胞漿和細胞培養上清檢測到NKG2D-IL-21融合蛋白的表達和分泌；并進一步觀察到經該融合基因修飾的CT-26細胞可刺激脾臟NK細胞活化，證明該重組基因表達的產物具有生物學活性。研究結果不僅從細胞層面證實該重組真核表達載體的有效性，還為進一步開發相應的基因疫苗、或基因修飾的腫瘤疫苗，用于臨床治療提供實驗依據。

NKG2D識別其配體MICA分子時，是由2個NKG2D同源二聚體形成復合物來結合1個MICA分子[9]，因此本研究制備的NKG2D-IL-21融合基因中含有2個NKG2D胞外結構域序列，將保證該基因的表達產物NKG2D-IL-21蛋白對其配體的結合功能。課題組前期利用重組DNA技術，在大腸桿菌表達NKG2D-IL-15融合蛋白，體內外實驗[10]均證實該蛋白具有很強的識別MICA/RAE-1陽性腫瘤細胞的活性。本文中制備的NKG2D-IL-21重組載體與NKG2D-IL-15相比，并未改變上游NKG2D的基因序列，因此理論上同樣具有較好的識別相應腫瘤細胞的活性。

盡管IL-21在體內主要由活化的CD4+T和NKT細胞分泌，其受體在體內廣泛表達，如T、B、NK、巨噬細胞、樹突狀細胞、皮膚及腸道上皮細胞[11]。IL-21可促進CD4+T細胞向Th2、Th17細胞分化，抑制調節性Treg細胞的分化，并促進B細胞的類別轉換，被認為是濾泡輔助性T細胞發揮活性的關鍵細胞因子[12]。IL-21信號通路活化后可明顯刺激NK和CD8+T細胞發揮細胞毒功能，促進顆粒酶和FasL的表達[13]。胰腺癌[14]和乳腺癌[15]細胞過表達IL-21分子，均可明顯抑制腫瘤的生長。外源性添加重組IL-21蛋白可明顯抑制小鼠腫瘤的生長，且與IL-2和IL-15相比，具有明顯的優越性[16]。結腸癌細胞經外源性NKG2D-IL-21融合基因修飾，刺激NK細胞活化后，是否發揮抗腫瘤活性，還期待進一步研究。

綜上所述，本研究將重組pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21載體轉染結腸癌細胞進行基因修飾后，證明該細胞直接具有刺激NK細胞活化的能力，為后續研發相應的腫瘤治療性IL-21基因疫苗以及表達IL-21相關基因工程蛋白，建立重要的前期工作基礎。

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Study of NK cell activation by colon cancer cells genetically modified with NKG2D-IL-21 fusion gene ex vivo

ZHAO Peilei, ZHAO Yijie, LENG Jie, GONG Weijuan

(TeacjimgandResearchSectionofImmunology,MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe effect of NK cell activation by colon cancer cell genetically modified with NKG2D-IL-21 fusion gene in a recombinant expression vector. MethodsFirstly, the recombinant vector, pcDNA3.1-NKG2D-IL-21, was identified with double restrictive enzymes for insertion of NKG2D and IL-21. After transfection by liposome and plasmid complex, expression of NKG2D-IL-21 fusion protein in CT-26 cells (a colon cancer cell line) was detected by an intracellular staining flow cytometry. Concentrations of NKG2D-IL-21 in cell-culture supernatants were measured by an ELISA assay. Finally, transfected CT-26 cells were co-cultured with mouse splenocytes overnight, and frequencies of DX5+CD69+cells were checked by flow cytometry. ResultsThe NKG2D-IL-21 fusion gene was stably inserted into pcDNA3.1. Ectopically transfection by NKG2D-IL-21 fusion gene in CT-26 cells leaded to express the corresponding protein. The secreted protein by CT-26 cells pre-transfected by the pcDNA3.1-NKG2D-IL-21 plasmid stimulated NK cells to express CD69. ConclusionThe pcDNA3.1-NKG2D-IL-21 plasmid can be considered as a new DNA vaccine to mediate anti-tumor activity.

KEYWORDS:NKG2D; IL-21; fusion gene; colon cancer; NK cell

通信作者:龔衛娟

基金項目:國家自然科學基金(81471547, 81172785); 江蘇省自然科學基金(BK2011449, BK2008215);

收稿日期:2015-09-10

中圖分類號:R 392.33

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)01-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201601001