穩健統計在快速生物降解性試驗質量分析中的應用

鄧桂榮，梅承芳，柳燕貞，張宏濤,4，陳澤芳，曾國驅,*

1. 廣東省微生物分析檢測中心 生態毒理與環境安全實驗室，廣州 510070 2. 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 3. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070 4. 佛山市環境健康與安全評價研究中心，佛山 528000

穩健統計在快速生物降解性試驗質量分析中的應用

鄧桂榮1,2,3，梅承芳1,2,3，柳燕貞1,2,3，張宏濤1,2,3,4，陳澤芳1,2,3，曾國驅1,2,3,*

1. 廣東省微生物分析檢測中心 生態毒理與環境安全實驗室，廣州 510070 2. 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070 3. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣州 510070 4. 佛山市環境健康與安全評價研究中心，佛山 528000

快速生物降解性試驗在新化學物質的生態毒理測試中占據重要地位，其測試數據的可靠性直接影響后續的測試策略和物質的申報登記、以及新化學物質進入環境后的風險管理。為研究OECD 301系列試驗(301B、301D和301F)的質量，選用本機構近5年來積累的標準化物質苯甲酸鈉14 d快速生物降解率數據，首次采用穩健統計技術，以穩健總計統計量的Z比分數作為評價指標，對各試驗數據和試驗系統的質量開展評估。結果顯示，當301B、301D和301F試驗的苯甲酸鈉降解率分別在63.8%～88.0%、63.4%～89.2%和66.0%～99.8%范圍內時，表明測試結果滿意，該批次試驗數據質量良好；若苯甲酸鈉降解率不在此范圍，則表明測試結果可能存在問題，甚至得到的可能是錯誤數據，需要進一步驗證。據此提出了對實際測試工作具有指導意義的質量分析對照表，以期為測試機構開展新化學物質快速生物降解性試驗時的質量分析提供參考。

苯甲酸鈉；快速生物降解性試驗；穩健統計；Z比分數；質量分析

化合物快速生物降解性是有機物作為唯一碳源在限定時間內與微生物接觸表現出的生物可降解能力[1]，是鑒別化學物質的環境危害性和持久性、進行分類和標簽[2]、評估和控制環境風險[3]的基本指標，也是我國實施新化學物質申報登記制度，對其進行環境風險管理的重要基礎[4-5]。因此快速生物降解性試驗數據的科學性、可靠性意義重大。而能基本確保試驗數據經得起推敲和質疑的，是與各快速生物降解性試驗配套的一系列質量控制指標，比如14 d程序對照組和毒性對照組的生物降解率等。

在經濟合作與發展組織(OECD)的6種經典快速生物降解性測試方法[6]中，判定試驗系統是否有效的重要觀測點是陽性參比物14 d的生物降解率是否達到了“通過水平”，即生物降解率大于60%或70%。然而，即使參比物的降解率達到方法的最低要求，試驗數據依然具有較大的可變性，嚴格來說并不能因此就斷定所得數據是科學、可靠的，有必要開展進一步的質量分析，評估該數據的可接受程度，進而對試驗系統的運行狀況做出有效判斷。近年來我國環境壓力不斷加大，新化學物質的管理也日趨嚴格，但主管部門的關注點僅限于所提供數據之于測試標準的遵循性和符合性，對數據質量未做額外要求。作為提供新化學物質測試數據且符合良好實驗室管理規范(GLP)的測試機構，采用科學的統計方法對即將用于申報的快速生物降解性試驗數據開展進一步的質量評估具有重要的科學意義和應用價值。目前，國內尚無關于快速生物降解性數據質量分析的相關研究和報道。

本文利用近5年來采集的OECD快速生物降解性301系列試驗[7](301B：CO2產生試驗[8]，301D：密閉瓶法試驗[9]和301F：測壓呼吸計量法試驗[10])中苯甲酸鈉的128個標準化的快速生物降解率數據，采用穩健統計分析技術，以基于穩健總計統計量的Z比分數作為表征和評價指標，評估試驗數據和試驗系統的質量，并給出對實際測試工作具有指導意義的質量分析對照表，以期為測試機構開展新化學物質快速生物降解性試驗時進行質量分析提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

苯甲酸鈉(≥99.5%)、磷酸二氫鉀(≥99.0%)、三水合磷酸氫二鉀(≥99.0%)、十二水合磷酸氫二鈉(≥99.0%)、氯化銨(≥99.5%)、無水氯化鈣(≥96.0%)、七水合硫酸鎂(≥99.0%)、六水合氯化鐵(≥99.0%)。

以上試劑中，苯甲酸鈉作為標準推薦使用的參比物之一，加入到試驗系統，其余用于配制試驗培養基。所有試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2 儀器設備

301B：3 L燒瓶(2 L反應液)，數顯滴定儀(Titrette，德國，BRAND GMBH + CO KG)，脫CO2裝置，空氣流量計；

301D：300 mL BOD瓶(充滿反應液)，溶解氧測定儀(Multi 3430，德國，WTW)；

301F：500 mL試驗瓶(一定體積反應液，留有上層頂空)，測試系統(OxiTop?Control，德國，WTW)，生化培養箱(SHP-350，中國，上海精宏實驗設備有限公司)。

1.3 接種物的采集與準備

試驗所用的接種物取自廣州地區2家主要處理生活污水且運行狀況良好的污水處理廠。

根據測試標準推薦，301B和301F試驗取用曝氣池末端的活性污泥，采集后去除粗糙顆粒和浮在表面上的雜質，再用試驗培養基離心清洗，棄除上清液，并將此接種物重新懸浮于試驗培養基中，在均勻狀態下取少量懸浮液測定混合液懸浮固體濃度(MLSS)[11]。試驗前，使用試驗培養基將其濃縮或稀釋，得到活性污泥濃度為4.0 g·L-1(以干重計)的接種物。保持有氧狀態直至使用。

301D試驗取用二級出水，不含有菌膠團。使用前，采用營養瓊脂培養基測定其可培養細胞總數[12]，達到104～106cell·mL-1培養基，方能滿足測試標準的要求。

1.4 試驗條件

所開展的盡管都是快速生物降解性試驗，但各個類型試驗的條件存在一定差異[13]，具體見表1。

1.5 方法

按照我國《化學品測試方法》[1,14]和OECD化學品測試導則[7]中的標準條件進行試驗，所有試驗均遵循GLP規范的要求[15-16]，操作步驟按照標準操作程序(SOP)的規定實施。

1.5.1 301B試驗

在已接種的無機培養基中加入適量的苯甲酸鈉作為唯一有機碳源。在黑暗條件下，用脫CO2的空氣以受控速率對試驗培養基進行曝氣。通過測定CO2的產生量來確定苯甲酸鈉的降解率。CO2用氫氧化鋇溶液吸收，使用Titrette數顯滴定儀滴定剩余的氫氧化鋇來測定CO2產生量。苯甲酸鈉產生的CO2數量用理論二氧化碳(ThCO2)的百分率來表示。

1.5.2 301D試驗

將苯甲酸鈉溶于試驗培養基，接種適量二級出水后，分裝至BOD瓶中，使BOD瓶完全裝滿，輕輕拍打BOD瓶以去除任何氣泡。密閉BOD瓶后置于試驗條件下培養，并在試驗期間使用Multi 3430溶解氧測定儀追蹤測定溶解氧消耗[17]來計算生物降解率。

1.5.3 301F試驗

向一定體積已接種的無機培養基中加入已知濃度的苯甲酸鈉貯備液作為唯一有機碳源，密閉試驗瓶后在試驗條件下連續攪拌培養。通過OxiTop?Control BOD測試系統測定瓶內壓力的變化，可得到耗氧量。釋放的CO2用NaOH顆粒吸收。苯甲酸鈉生物降解過程中的耗氧量用空白對照組校正，微生物種群吸收氧的量以理論需氧量(ThOD)的百分率來表示。

1.6 數據統計

1.6.1 301B試驗降解率的計算

本試驗以氫氧化鋇溶液作吸收劑，根據HCl滴定體積，計算空白對照組和苯甲酸鈉試驗組所產生的CO2量，二者之差即為苯甲酸鈉生物降解產生的CO2量。將CO2量除以加入試驗體系的苯甲酸鈉的TOC含量與以碳轉換CO2系數3.67的乘積，即為苯甲酸鈉降解百分率[8]。

1.6.2 301D和301F試驗降解率的計算

用第14天的苯甲酸鈉試驗組耗氧量減去相應的空白對照組耗氧量，再除以苯甲酸鈉濃度，得到用毫克氧比毫克苯甲酸鈉表示的BOD，結合ThOD可計算301D試驗中苯甲酸鈉降解百分率[9]。

301F試驗中苯甲酸鈉降解百分率計算方法類似于301D試驗，只需用測得的BOD替代耗氧量計算即可[10]。

1.6.3 降解百分率的穩健統計

穩健統計前，應用SPSS Statistics 16.0軟件的單個樣本的K-S檢驗(One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test)，對各試驗的苯甲酸鈉降解率數據進行正態分布檢驗。

針對2010年至2014年在本機構開展的128個標準化的苯甲酸鈉14 d快速生物降解性結果，使用通用的穩健統計方法[18-22]處理，計算穩健Z比分數，分析各數據在總體數據中所處的位置。

計算公式：

Z=(X-Xm)/標準化IQR(X)

式中：

Z—穩健比分數；X—降解率結果；Xm—各類型試驗所有降解率數據的中位值；標準化IQR—即IQR與因子0.7413的乘積。

表1 快速生物降解性試驗條件Table 1 Test conditions of ready biodegradability tests

所涉及的統計量還有四分位數值、變異系數、最小值、最大值和極差等。

應用Microsoft Office Excel 2003軟件[23]作穩健Z比分數序列圖，圖中按照大小的順序顯示出各試驗數據的穩健Z比分數，并標有相應的試驗編號。

將各降解率結果換算為概率單位[24]后，使用origin 8軟件以概率單位對試驗編號作圖。

2 結果與分析(Results and analysis)

表2給出了各類型試驗數據統計結果。

K-S檢驗結果表明，301B、301D和301F試驗的苯甲酸鈉降解率數據的雙尾漸進顯著性概率分別為0.723、0.705和0.830，均大于0.05，因此所得數據服從正態分布，適用基于穩健總計統計量的Z比分數統計。

評價數據時，采用穩健Z比分數作為評價指標，該值受數據中離群值影響較小。Z比分數的“+”與“-”分別代表了某個測試值偏離中位值的方向，也反映該測試值的系統誤差，同時還反映測試值與穩健值的偏離程度，Z比分數越接近X軸，表示當次苯甲酸鈉降解率結果偏離程度越小，數據的可接受程度越高，相反，偏離程度越大，相應批次試驗所得數據越趨于異常。依據評價原則[18,25]，當|Z|≤2時表示測試結果滿意，該批次試驗數據質量良好；當2<|Z|<3時表示結果可能存在問題，項目負責人(SD)應引起重視，并進行復查，尋找出現較大偏差的原因，以進一步提高數據質量；當|Z|≥3時表示結果不滿意，屬于統計分析中的離群值，SD應慎密檢查，找出問題所在，并制定有效的糾正措施，糾正偏離。如有必要，應重新啟動試驗加以驗證。

表2 苯甲酸鈉降解率數據統計結果Table 2 Statistical results of sodium benzoate biodegradation data

注：*分別取最小降解率和最大降解率，以及與其相鄰的一個值。

Note: The min, max value and its adjacent were obtained respectively.

由數據統計結果可知，301B試驗中，降解率的最值處均出現了可疑值，其穩健Z比分數分別為-2.400、-2.065和2.007、2.836，超出了|Z|≤2范圍，對應的降解率分別為60.0%、62.3%和90.3%、96.0%，表明當降解率≤62.3%或≥90.3%時，結果可能存在問題。其余結果均為滿意，數據質量良好。301D試驗中，可疑值僅出現在最大降解率和次最大降解率處，其穩健Z比分數分別為2.463和2.044，對應的降解率為95.0%和98.3%，即當降解率≥95.0%時，試驗結果可能存在問題甚至離群，應復查或驗證。對于301F試驗，降解率62.8%～66.0%是存在問題的結果，其對應的穩健Z比分數分別為-2.345～-1.977，因此應關注并分析降解率≤66.0%的結果。另外，盡管301D試驗最小降解率對應的Z比分數為-1.968，301F試驗最大降解率對應的Z比分數為1.920，其絕對值均小于2.0，未指示結果異常，但在具體的實踐過程中，若遇到該接近臨界的數據，即當301D試驗降解率小于63.4%和301F試驗降解率大于99.8%時，SD也應注意，慎重分析，因為就目前的數據仍無法判斷該數據的質量水平。3類試驗的降解率對應的穩健Z比分數均未出現|Z|≥3，即苯甲酸鈉降解率合格程度達100%，無不滿意或離群的情況。

表3為快速生物降解性試驗質量分析對照表，是對上述結果的總結。

圖1為概率單位趨勢圖，從中可以看出各類型試驗生物降解率的趨勢。圖2至圖4為穩健Z比分數序列圖，直觀地顯示3類試驗中苯甲酸鈉生物降解率的穩健Z比分數分布情況，可清楚地看出每一個試驗苯甲酸鈉降解率與其他試驗的比較結果，且可清晰地辨別出可疑值和離群值。

圖2 OECD 301B試驗穩健Z比分數序列圖Fig. 2 Z-score sequence diagram of OECD 301B test

圖3 OECD 301D試驗穩健Z比分數序列圖Fig. 3 Z-score sequence diagram of OECD 301D test

圖4 OECD 301F試驗穩健Z比分數序列圖Fig. 4 Z-score sequence diagram of OECD 301F test

表3 快速生物降解性試驗質量分析對照表Table 3 Comparison table of quality analysis of ready biodegradability test

3 討論與結論(Discussion and conclusion)

穩健統計技術通常用于實驗室間或實驗室內的能力驗證或結果比對活動，較多是分析樣品對的結果，但也適用于單個樣品的驗證計劃[18]。鑒于本文所涉及的試驗多數由不同的技術人員操作，因此，在一定程度上可將這些試驗結果看作實驗室內部人員比對。

對各類型試驗中苯甲酸鈉的14 d降解率進行穩健統計分析的意義在于，通過對過往結果的質量分析，測試機構可知在現有的試驗條件下，哪些數據是可疑值或離群值。例如，當降解率≤62.3%和≥90.3%(301B)，或≥95.0%(301D)，或≤66.0%(301F)時，SD應提高警覺。若試驗正在進行，應密切關注試驗進程，發現問題后及時采取糾正措施，避免試驗失敗。若試驗已經完成，應仔細檢查分析測試過程的各個環節，如溶液配制方法、體系準備、儀器設備的穩定性和可靠性及誤差來源等，從技術層面上進行全方位評價，找出產生“可疑”或“離群”的原因，評估該批次試驗數據的可接受程度。基于測試機構大量數據而開展的穩健統計分析和評估，可以反映測試機構的整體數據質量，反映該測試機構的技術水平，進而獲得提高數據質量的方法。由此可見，穩健統計技術Z比分數的應用，對測試機構及時發現質量問題、提升數據質量、提高工作效率，具有重要的應用價值。

開展快速生物降解性試驗時，可將第14天苯甲酸鈉的降解率數據與表3進行對比，對該試驗數據的質量情況做出一個初步判斷。然而，盡管文中涉及的試驗均始終按照標準方法操作，項目實施和原始記錄等都經質量保證部門(QAU)的檢查并確認符合GLP規范和SOP規定，但所得數據仍然具有局限性，比如在苯甲酸鈉生物降解過程中起關鍵性作用的接種物僅取自廣州2家生活污水處理廠，缺乏以廣州地區其他生活污水處理廠和廣州以外地區生活污水處理廠為接種物來源的相應苯甲酸鈉降解率數據。而楊倩等[26]和楊婧等[27]研究指出，接種物易受到污水處理廠本身運行工藝、不同地區的自然經濟環境以及人們生活習慣等因素影響，微生物群落結構呈現差異性，進而影響到試驗的重復性及結果間的可比性。Ginkel等[28]、Vázquez-Rodríguez等[29]和Dechrugsa等[30]也指出，接種物來源不同，同一個化合物的快速生物降解性會呈現不一致性，因為接種物不同，其組分尤其是微生物種群存在較大差異。另外，上述苯甲酸鈉快速生物降解性試驗僅在本機構完成，未與其他機構進行實驗室間結果比對，不具備普遍適用性。因此如需進行類似數據評估，建議根據實際情況設計一個完整的穩健統計分析，進而得到更有針對性和指導性的質量分析對照表，從而有效避免出現誤判的情況。

特別指出，由穩健Z比分數分析得出試驗結果可疑甚至離群時，并不等同于該試驗無效，只是指示該試驗系統可能存在嚴重的問題或發生偏離，此時應針對試驗的各個環節開展全面的檢查和深入分析。只有當該試驗結果滿足所有相應的質量控制要求時，方能判定試驗為有效。

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◆

Application of Robust Statistic Method in Quality Analysis of Ready Biodegradability Test

Deng Guirong1,2,3, Mei Chengfang1,2,3, Liu Yanzhen1,2,3, Zhang Hongtao1,2,3,4, Chen Zefang1,2,3, Zeng Guoqu1,2,3,*

1. Laboratory of Ecotoxicity and Environmental Safety, Guangdong Detection Center of Microbiology, Guangzhou 510070, China 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China 3. State Key Laboratory of Applied Microbiology, Southern China, Guangzhou 510070, China 4. Foshan Research Center for Environmental Health and Safety Assessment, Foshan 528000, China

Received 30 March 2016 accepted 5 May 2016

Ready biodegradability test plays an important role in ecotoxicity testing of new chemicals. The reliability of ready biodegradation test results directly determines the subsequent testing strategy and affects the registration and declaration of new chemical substances, as well as the risk management after entering environment. In order to study the data quality of ready biodegradability series tests (OECD 301B, 301D and 301F), Z-score of robust statistics method was firstly used to analyze the 14 d biodegradation data of sodium benzoate which were produced by our laboratory in the past 5 years. The results showed that, when the biodegradation rates of sodium benzoate of 301B, 301D and 301F are within the range of 63.8%-88.0%, 63.4%-89.2% and 66.0%-99.8%, respectively, it indicates that the test results are satisfactory and the data quality are good. Otherwise, it means that there are some problems with the data and further verification is needed. As a result, a comparison table of quality analysis of ready biodegradability test was constructed for providing the references for quality analysis of ready biodegradability test of new chemical substances.

sodium benzoate; ready biodegradability; robust statistic; Z-score; quality analysis

新材料環境健康安全評價科技創新服務平臺(廣東省科技計劃項目，2013B090800004)

鄧桂榮(1984- )，男，工程師，研究方向為生態毒理學，E-mail: deng8818@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zenggq@gddcm.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160330004

2016-03-30 錄用日期：2016-05-05

1673-5897(2016)6-259-07

X171.5

A

曾國驅(1966-)，男，博士，研究員，主要研究方向為生態毒理學，發表學術論文30余篇。

鄧桂榮, 梅承芳, 柳燕貞, 等. 穩健統計在快速生物降解性試驗質量分析中的應用[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 259-265

Deng G R, Mei C F, Liu Y Z, et al. Application of robust statistic method in quality analysis of ready biodegradability test [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 259-265 (in Chinese)