分子生物學技術在環境微生物檢測和污染治理中的應用

闞金蘭

( 西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621000)

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分子生物學技術在環境微生物檢測和污染治理中的應用

闞金蘭

( 西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621000)

摘要綜述了聚合酶鏈式反應技術(PCR)、生物芯片技術、酶聯免疫吸附技術(ELISA)、生物傳感器4 種現代分子生物學技術的基本原理及其在環境微生物檢測和治理中的應用，以期為現代分子生物學技術在環境微生物檢測和治理中的進一步研究提供參考。

關鍵詞環境微生物；聚合酶鏈反應；生物芯片；酶聯免疫吸附技術；生物傳感器

隨著分子生物學技術的不斷發展，新的微生物檢驗技術和方法被廣泛研究和應用。近年來經過國內外學者不斷努力，已建立了多種快速、簡便、特異和低耗的微生物檢驗技術和方法。分子生物學技術為研究微生物種群多樣性、菌種鑒定和分析提供了全新的技術手段，大大提高了對復雜微生物體系的認識和分析能力。微生物是生態系統中的分解者， 有助于水體自凈和水體修復。微生物可去除有機污染物和無機污染物，為保護和修復環境創造了條件。微生物在環境監測和治理中存在兩面性，水環境與微生物之間相互依存又互相影響。筆者綜述了近年來應用于各種環境微生物檢測和治理中的分子生物學技術及其應用，以期為相關的研究提供參考。

1幾種分子生物學技術及其在環境微生物檢測中的應用

1.1聚合酶鏈式反應 聚合酶鏈式反應( Polymerase Chain Reaction，PCR)技術是美國科學家 Mullis等[1]發明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,又稱基因的體外擴增。此反應以4種脫氧核苷酸為底物，在耐高溫聚合酶的作用下,對DNA序列進行擴增。PCR技術的基本原理與DNA的天然復制過程相似，其特異性由寡核苷酸引物決定。PCR由變性、退火、延伸3個基本步驟構成：①變性。模板DNA經加熱至93 ℃左右后或在堿性條件下，DNA雙鏈的氫鍵斷裂，雙鏈DNA解離成為單鏈，稱之為DNA變性，以便與引物特異性結合； ②退火。溫度降至55 ℃左右后，解離后的單鏈DNA與引物特異性結合，形成局部雙鏈，引物一般根據目標DNA序列人工合成； ③延伸。在Taq酶的最適溫度(72 ℃)下，以引物3′端為合成起點，以單核苷酸為原料，在 72 ℃下，TaqDNA 聚合酶從引物的 3′端起始，dNTP為底物，靶序列為模板，以5′→3′方向延伸，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成DNA新鏈。重復循環變性、退火、延伸過程即可獲得更多的新鏈，這種新鏈又緊接著成為下次循環的模板。由此看來，PCR 反應速度極快，待擴增基因呈2n倍擴增，幾個小時內單拷貝的基因經30個左右循環即可擴增百萬倍[2]。PCR 技術中， 設計引物的質量至關重要。在使用 Primer Premier 5.0 等軟件進行引物設計時， 要對引物的5′端和3′端進行修飾。為提高擴增產物的量，可以將產物DNA稀釋100倍左右作為第二輪模板進行擴增，一般二次擴增后的DNA數量能滿足所有分子生物學操作的要求。與傳統的微生物檢測方法相比，PCR 具有特異性強、靈敏度高、操作快捷、迅速省時等優點。

目前，PCR技術在微生物檢測中運用最廣泛的是對樣本中病原微生物的核酸進行檢測。通過在反應試管中同時加上多種病原微生物的特異性引物進行擴增，可鑒定出一種以上的病原體。此技術不受混合標本多少和微生物生長時間長短的限制，即便存在大量死菌也能得到準確結果，如對乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和禽流感病毒的檢測等。PCR技術可改變微生物檢測的方式和方法，促進分子生物學和環境微生物學、醫學的相互發展，使微生物檢測可在分子水平上確診，而不再局限于外部特征、形態結構和生理特性等。

1.2生物芯片技術生物芯片技術是20世紀90年代以來影響深遠的科技進展之一，是融合微電子學、生物學、物理學、化學和計算機科學等學科為一體的高度交叉的尖端新技術[3]。按照芯片上固化的生物材料不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質芯片、多糖芯片等；根據反應體系狀態的不同，可分為固相芯片和液相芯片。液相芯片較傳統的固相芯片相比，檢測結果更準確，信息質量更穩定，檢測用時更少以及操作更簡便。因此，液相芯片更廣泛地應用于生命科學研究的各個領域，特別在病原菌感染的檢測方面，具有廣闊的應用前景。法國某企業開發了一種生物芯片，可隨時檢測飲用水中微生物的變化[4]。目前，液相芯片技術在基因檢測、細胞檢測、蛋白質分析和藥物檢測等方面運用廣泛，是臨床檢測和科學研究的推動力[5]。

1.2.1基因芯片技術。隨著“人類基因組計劃”的完成，基因芯片技術已發展成為生物芯片技術一個最完備的分支，迅速成為國內外研究的熱點。其原理是根據核酸的分子雜交衍生而來，用已知序列的核酸探針對未知序列的核酸序列進行雜交檢測[6]，通過雜交信號進一步分析目的序列。基因芯片又稱 DNA 微 陣 列(DNA microarray)，可以分為兩類 ：一是 cDNA 芯片，用于表達譜的研究，二是寡核苷酸芯片，用于表達譜的研究和基因組學的相關研究。基因芯片技術的興起給微生物檢測帶來了新的技術革命，近年來已有此技術應用于大腸埃希菌、痢疾志賀菌、傷寒沙門菌檢測的報道[7]。基因芯片技術還可用于檢測多部位基因序列和基因變異，具有檢測突變點多、準確性高、快速等優點。基因芯片技術廣泛應用于病毒病的流行病學調查，可達到對傳染病的流行進行預測和防控的目的。在環境微生物學中，基因芯片技術可用于檢測環境微生物群落的組成結構、生理狀態、功能活動和系統發育等。

1.2.2蛋白芯片技術。蛋白芯片技術作為生命科學研究的新技術平臺，可以彌補基因芯片技術的不足，能在翻譯水平上對蛋白、 抗體等進行檢測。蛋白芯片技術的原理是利用抗原抗體的特異性結合，而基因芯片技術的原理是通過堿基的特異性互補配對。蛋白芯片技術的研究對象是蛋白質，通過對固相載體進行特殊化處理，將已知的蛋白產物固定在酶、抗原、受體等載體上，根據這些生物分子的特性，即可捕獲與之特異性結合的待測蛋白，后經洗滌、純化，再利用熒光掃描技術，測定芯片上各點的熒光強度，進行確認和生化分析，可判斷生物體中是否含有該蛋白對應的轉基因成分，進一步還可測定該蛋白質功能。蛋白芯片技術的快速發展，有力地促進了蛋白診斷和蛋白質組學等相關研究。蛋白芯片技術可應用于艾滋病病毒的檢測和鑒定、乙型肝炎表面抗原的鑒定和血清中多種抗體的同時檢測等。

生物芯片技術與傳統微生物檢測方法相比，樣品需求量少，檢測效率高，快速直接，可方便快捷地幫助醫學工作者揭示疾病發生的分子機制，從而尋找更為合理有效的治療方法和途徑，在微生物檢測領域具有廣闊的發展前景。

1.3酶聯免疫吸附測定技術(ELISA)ELISA是將酶的催化作用與抗原抗體特異性技術手段相結合而建立的一種超微量的測定技術。ELISA法是在熒光免疫和放射免疫分析的基礎上發展起來的,酶標記抗原或抗體后，不會影響抗原抗體的活性和酶自身的活性。對受檢樣品中的酶標免疫反應的試驗結果，用光學分析儀器進行光度測定。此技術特異性強，靈敏度高，檢測用時短，成本價格低，判斷結果精確等，已被廣泛應用于食品安全檢測和污染物中農藥殘留量的檢測。有些發達國家如美國、德國已開發出試劑盒應用于食品、蔬菜和環境中農藥殘留的檢測分析[8]。

1.4生物傳感器生物傳感器集微電子學、材料科學和生物技術等多種學科，是一種對生物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。生物傳感器是一個獨立的、完整的裝置，通過利用與換能器保持直接空間接觸的生物識別元件，提供特殊的定量與半定量分析信息。生物傳感器由生物識別元件和換能器兩部分組成。采用常用識別原件如酶、抗體、核酸、細胞受體等識別待測物的濃度等，然后轉譯為一定靈敏度的生物活性信號，再由換能器將生物活性信號轉換為電信號。常用的換能器有電化學器件、光電管、聲波器件、壓電器件和熱敏電阻器等。生物傳感器應用十分廣泛，可用于水環境和大氣環境的檢測、微生物細胞數目的測定，其在發酵工業、環境監測、醫學領域等也早有應用。白志輝等[9]利用硫化物桿菌制成硫化物傳感器，應用于生活污水、工業廢水等樣品中的硫化物測定。

微生物傳感器是將微生物細胞與換能器結合在一起，所固定的微生物可以是有活力的細胞，可利用其呼吸代謝作用；也可以是無活力的微生物細胞，常被用作酶的廉價替代品。微生物傳感器具有3個優點：①穩定性好，使用壽命長；②專一性強，只對特定的底物起反應，且不受顏色、濁度的影響；③可克服酶提取困難、價格昂貴和不穩定的缺點[10]。

2分子生物學技術在環境微生物治理中的應用

現代分子生物學技術可從微觀角度分析污染物的組成成分，從而降解污染物，有助于治理環境污染，既快速又高效。利用分子生物學技術篩選有價值的功能性微生物并加以培養和利用，對污水處理效果明顯。利用微生物處理環境污染物具有快速、低耗、成本低、反應條件溫和以及無二次污染等優點。因此，科學家運用基因工程技術構建高效菌種來治理環境中難以降解的復雜毒害化合物，如人工合成塑料、除草劑等。超級細菌在石油烴污染的環境修復中起到了重要作用：將微生物分解纖維素和木質素的基因轉入中溫細菌中,使發酵在較高溫度下也能進行，還可用于發酵廢棄物產生天然氣[11]。隨著人們對環境保護意識的加強和分子生物學技術研究的不斷進步[12]，環境污染治理的相關研究已滲透到各個科學技術領域。近年來,消除重金屬污染一直是世界性難題，人類運用植物提取修復技術消除重金屬污染物已取得顯著成果[13]。其原理是將環境中殘存的重金屬污染物吸收、富集到植物體內,然后將植物經過焚燒等途徑回收重金屬,以此減少重金屬對環境的污染。植物提取修復技術操作簡單，效益高，具有很大的經濟價值[14]。

3結語

隨著現代分子生物學技術的迅速發展，運用各種生物學技術鑒定污水中微生物種群和基因型,更進一步掌握污水生物處理系統中微生物群體的多樣性和功能特點，從而達到環境污染治理的目的。隨著分子生物學技術的日趨成熟，分子生物學技術越來越多地被應用于污染治理研究中,因其高度的特異性、靈敏性在環境微生物污染治理中的應用必將更為廣泛。從分子水平上闡述污水生物處理的機制，對微生物環境治理具有深刻的理論意義與應用價值。新技術的日益成熟必將對環境微生物的研究有一個整體的、系統的認識,也必將使研究更具目標性和可控性。

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Application of Molecular Biology Technology in Environmental Microbe Monitoring and Management

KAN Jin-lan (College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621000)

AbstractThe basic principles of 4 kinds of modern molecular biology techniques including polymerase chain reaction(PCR)，biochip technology，enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)，biosensors were reviewed，as well as their application in environmental microbe monitoring and management. The aim was to provide reference for further research of modern molecular biology technique in environmental microbe monitoring and management.

Key wordsEnvironmental microbes; Polymerase chain reaction; Enzyme labeled immunosorbent assay; Biosensor

收稿日期2015-12-14

作者簡介闞金蘭(1993- )，女，四川成都人，本科生，專業：生物工程。

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-171-03