玉米單倍體技術的利用研究與發展前景

宋俏姮，楊躍華，孔亮亮，劉俊峰

(四川省農業科學院水稻高粱研究所，四川德陽 618000)

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玉米單倍體技術的利用研究與發展前景

宋俏姮，楊躍華，孔亮亮，劉俊峰

(四川省農業科學院水稻高粱研究所，四川德陽 618000)

摘要闡述了單倍體誘導技術在玉米育種中的應用優勢、單倍體的誘導機理和遺傳規律、玉米單倍體育種技術的必要環節以及國內的利用現狀，同時討論了目前單倍體技術應用的局限性和困難，并展望了該技術在鮮食玉米育種中利用的可能。

關鍵詞玉米；單倍體技術；誘導育種；發展前景

我國是全球第二大玉米生產國和消費國，玉米產量和品質的提高需要不斷改良發展育種手段。選育高產、高抗、高配合力的自交系是玉米育種中的基礎和核心環節。單倍體育種是指利用植物單性生殖的方法，使其形成單倍體后通過自然或人為的方式對其染色體進行加倍，成為純合二倍體(即純系)，再從中選育新品種(系)的方法。單倍體誘導育種與常規育種手段相比具有明顯優勢：①它通過控制雜種分離，2個世代便可得到純合二倍體，加快了自交系的選育，顯著縮短了育種周期；②由于單倍體形成的二倍體是高度純合的，沒有顯性性狀的掩蓋，通過植株就能直觀地對隱性性狀進行篩選，從而降低誤選率，有效提高育種效率和節約育種成本；③能夠與其他育種手段相結合，克服遠緣雜交育種的不育，提高誘變育種的效率，形成的純合二倍體可作為分子標記輔助育種和轉基因育種的優良材料。因此，弄清單倍體的誘導機理和遺傳規律，了解掌握國內單倍體誘導育種現狀有助于更好地利用單倍體技術進行育種選系。

1單倍體的誘導機理和遺傳規律

單倍體(haploid)指體細胞中只攜帶有配子染色體數目的個體。單倍體可自然發生，也可通過人為方式誘導產生，而單倍體的誘導機理目前仍沒有明確的定論。學術界對此普遍持三大觀點：①精核異型，認為有少量異常花粉存在于成熟的花粉細胞中，這部分花粉的2個精核形態1個正常，1個偏大未成熟或偏小已衰老，無法正常參與受精，這種單受精可能會誘發卵核產生單倍體胚；②染色體排除，在雜交過程中若雙親體細胞分裂周期不同步或者核蛋白質合成時間不同步，造成一方親本的染色體丟失，形成單倍體[1]；③精核生殖單位的破壞，2個精細胞在花粉管中同時到達胚囊助細胞才能保證雙受精，若2個精子分開運輸，未能同步到達胚囊，只有1個精子參與了受精，與極核融合后可能發育成單倍體[2]。

單倍體只擁有1組染色體，所攜帶的所有基因都是單一的，但同時配子體是一個完整協調的新陳代謝體系，具有正常的生理功能。研究發現單倍體攜帶的基因在后代的分離是隨機的，并且后代的基因型和表現型完全一致，無論是顯性基因還是隱性基因控制的性狀都能夠真實直觀的顯現。單倍體通過對配子體直接進行選擇，加倍后所得到的雙單系的遺傳組成100%純合，具有穩定的遺傳性，自交后代的數量性狀等遺傳變異也完全相同，不會出現性狀分離[3]。

2單倍體技術體系和國內利用現狀

常規育種手段選育玉米自交系需要6～8代，難以滿足生產上對品種快速更新換代的要求。單倍體技術只需利用誘導系與目標材料雜交誘導、鑒選出單倍體、對單倍體二倍化即可獲得100%純合的自交系，該技術已成為國內外大型種子公司選系的重要手段，與分子標記輔助育種技術和轉基因育種技術形成了現代育種技術新體系。我國對單倍體技術的利用起步較晚，但發展很快，獲得了大量研究成果。

2.1單倍體誘導系的創制單倍體誘導途徑有離體培養、利用射線或化學藥物處理和活體誘導等。利用孤雌生殖誘導系雜交產生單倍體是一種誘導頻率高、操作簡捷、成本低廉的方法，易于在玉米育種中大規模推廣[4]，優良的誘導系是單倍體技術的利用前提和基礎。1959年Coe發現美國Northrup King公司的1份玉米材料作父本與其他玉米材料雜交后會產生一定比例的單倍體，為了從表型上區分出單倍體，導入籽粒色澤標記基因R-nj和植株色澤標記基因ABP1，將其命名為Stock6，這是第一個面世的單倍體誘導系[5]。國外學者在Stock6的基礎上進行了不斷改良，1988年法國Lashermes從W23ig和Stock6雜交產生的F3代選育出WS14[6]。KMS、ZMS、MHI、RWS等高頻誘導系的創制，克服了Stock6的諸多缺陷。

我國第一個單倍體誘導系是1998年劉志增和宋同明通過Stock6與高油玉米改良群體BHO雜交選育出的農大高誘1號[7]，至此打破了國外對單倍體誘導系的壟斷。此后國內綜合性狀優良、誘導頻率高且穩定的單倍體誘導系不斷被創制出來。陳紹江[8]通過農大高油高誘1號與UH400雜交組配，育成農大高誘2號、3號、4號、5號一系列新誘導系。才卓[9]運用Stock6和M278組配選育了吉高誘系3號。華中農業大學張姿麗和邱法展選育出誘導系HZI1[1]。廣西農業科學院楊耀迥[10]通過B1和高誘1號雜交，育成Y8。目前國內單倍體誘導系的誘導率和抗病性均有提高，投入生產應用已成功得到雙單倍體材料，然而研究發現由于目前創制的誘導系多為溫帶誘導系，在熱帶或亞熱帶利用時易出現誘導率不穩定、花粉量少、病害重等問題，且大多數是在Stock6的基礎上選育，而用于改良Stock基礎材料有限，限制了適應當地生態條件誘導系的創制。

2.2雜交誘導獲得單倍體雜交誘導是單倍體育種的第一環，單倍體的數量關系到能否順利開展后續步驟，為了盡可能多地獲得單倍體，應選用誘導率高且穩定、遺傳標記明顯和綜合性狀優良的誘導系作父本，選擇抗性佳、豐產性高、植株生長勢強、品質優良的玉米材料作母本。蘇月貴[11]利用Stock6誘導 20份熱帶硬粒型玉米材料，誘導率均值為2.84%，這與普遍認為Stock6的誘導率為3%的結論基本一致，而其變化幅度在0.84%～7.10%，推測原因為熱帶玉米種質的遺傳背景不同。張如養[12]通過京科誘041、043、044、045和京科誘005、006分別與6個不同基礎種質類型的自交系雜交誘導后，發現6個誘導系的誘導率均值差異極大，其中京科誘043誘導率均值最高，達6.06%，京科誘041和045誘導率最低，為2.45%，這種誘導率的差異可能是受到父本基因型的影響。江禹奉[13]通過高誘1號與6份熱帶玉米材料雜交誘導，結果顯示高誘1號誘導率均值為1.66%。李國良[14]研究認為高誘1號的誘導率均值為3.90%，低于劉志增[7]的研究結果(5.8%)。孫瑞[15]比較了高誘1號、高誘5號和MT1、MT2與國內四大種質類群旅大紅骨、瑞德、蘭卡斯特、唐四平頭雜交后誘導率的差異，結果表明高誘5號誘導率最高，均值達3.13%，蘇娟娟[16]的研究顯示高誘5號的誘導率為9.76%，顯著高于另外3個誘導系，推測與母本種質基因型和種植條件有關。2014年劉麗[17]報道稱不同玉米產區的誘導率存在差異，通過MT1誘導國內代表性玉米自交系后顯示北方春播玉米區誘導率最高，為5.16%，其次為南方丘陵和西南山地玉米區，為5.14%，黃淮海夏播玉米區最低為4.44%。

單倍體誘導率的差異不僅受到誘導系自身誘導能力和穩定性的影響，同時與母本基因型和遺傳背景、種植環境、授粉時花絲長度、育種者經驗程度等因素有關，而誘導系與母本材料的合理搭配還需進一步探索。

2.3單倍體的篩選與鑒定單倍體的鑒定方法包括遺傳標記鑒定法、形態學鑒定法、細胞學鑒定法、解剖學鑒定法、流式細胞儀鑒定法、分子標記鑒定法和生理生化鑒定法[18]。結合遺傳標記和田間植株形態篩選玉米單倍體在實際操作中最為簡便。誘導系攜帶的籽粒色澤遺傳標記基因R1-nj，雜交誘導后獲得的單倍體籽粒頂端糊粉層顯紫色、胚部或胚芽尖無顯色；若誘導系同時攜有控制不定根、葉鞘、莖稈形成紫紅色植株色澤標記基因ABP1-1，所誘導產生的單倍體后代幼苗葉鞘不顯紫色[19]。研究認為理想情況下，運用籽粒和植株雙顯性遺傳標記篩選出的單倍體準確率可高達98%，但僅通過花青素顏色基因來鑒定容易受到基礎材料遺傳背景、CI或Idf等色素抑制基因、籽粒成熟度和含水量、基因表達的劑量效應和操作者的主觀判斷等因素影響，結合田間表型特征能夠顯著提高鑒定結果的準確性。與正常的二倍體植株相比，單倍體植株較矮、生長發育慢、葉片顏色淺，雌雄花期往往不協調，雄穗不育或育性極低[20]。

高軍[21]認為利用遺傳標記來篩選玉米單倍體是最有效可靠的方法，可以有效避免肉眼通過植株形態鑒定所產生的誤差。而Rober[22]研究提出籽粒色澤標記基因R1-nj在歐洲硬粒型玉米和熱帶玉米種質上的顯色程度不佳。2003年陳紹江[23]運用高油分的花粉直感效應來篩選單倍體，由于農大高誘1號含油量高，花粉直感效應明顯，以自交籽粒含油量為對照，雜交誘導后產生的籽粒用核磁共振儀測定油分含量，低于自交籽粒的即為單倍體籽粒，準確率達90%以上，該法適用于高油誘導系且后代遺傳標記不明顯的材料，如CHOI1。黎亮[24]提出可以通過流式細胞儀定量分析植物體內細胞DNA含量，快速準確篩選出單倍體，且不受取材部位限制。利用分子標記檢測多態性差異，與母本帶型一致的為單倍體，帶型表現同時具有雙親基因型的為雜合二倍體。用顯微鏡鏡檢根尖或莖尖分生組織，通過染色體數目來判斷單倍體也是一種準確有效的方法。準確地篩選出單倍體不僅依賴于育種家的經驗技術，在生產實踐中還需要根據具體育種情況靈活運用并不斷予以豐富發展，以克服目前鑒定方法中固有的弊端和局限性。近年來自動化分揀技術受到了關注，例如運用計算機視覺技術系統通過籽粒的胚乳和胚部的顏色特征判別單倍體；利用核磁共振儀基于油分花粉直感效應原理開發出全自動分揀系統；通過近紅外反射光譜結合SIMCA模型實現快速鑒選出單倍體等。

2.4單倍體的加倍單倍體植物高度不育，只有進行染色體加倍才能使其成為可育的二倍體。雜交誘導產生的玉米單倍體90%以上的雌穗均能夠正常吐絲，然而一般情況下雄穗能自然恢復育性的不超過10%(不同基因型材料間差異很大)，因此單倍體雄穗育性問題是單倍體誘導育種應用中的限制性難題。研究認為，單倍體恢復二倍性或許是細胞的一種本能反應，但受到遺傳背景和環境條件的影響，某些材料不發生自然加倍，依靠極低的自然加倍率很難滿足育種實踐，更多的需要進行人工處理以獲得DH系[25]。

常用的人工加倍方法有浸種法、浸芽法、浸根法、注射法、涂抹法、包埋法和滴心法等。目前運用較多的是秋水仙素配以二甲基亞砜，通過浸種、浸芽、浸根或注射的方式[26]對單倍體進行處理，在細胞有絲分裂時期，打破紡錘絲的形成，使染色體不向兩極移動而停留在赤道板附近，從而使有絲分裂失敗而實現加倍[27]。劉俊[28]用0.06%秋水仙素與2.0%二甲基亞砜對不同基因型母本材料誘導產生的單倍體通過浸根法、滴心法、針刺生長點法進行加倍處理，結果顯示針刺生長點法的加倍率最高，達23%。王賀[29]用0.07% 秋水仙素處理芽尖8 h，加倍率高達16.5%。韓學莉[30]發現0.05%秋水仙素處理時，浸種法和浸芽法藥害率低但加倍效果較差，浸根法加倍率高同時藥害較重，注射法最為理想。文科[31]研究認為浸根藥害最重，浸種和注射加倍率較高，但注射法對植株傷害較重。加倍效果與環境、加倍方法和材料類型的關系密切，通常來講浸種法是藥害程度最低的辦法，但其加倍效果還有待于進一步優化。秋水仙素為淡黃色劇毒粉末，在加倍實驗中使用的濃度為0.02%～0.08%，需要專業人員小心操作。目前已有使用細胞分裂抑制劑(如APM、氟樂靈、拿草特、氨磺靈)、除草劑或一氧化二氮來替代秋水素的相關研究，然而加倍率不甚理想，未來期望發現更多無毒或低毒的高效加倍劑或加倍途徑，以減少操作的危險性，并獲得更好的加倍效果。

3展望

單倍體技術在玉米育種中的應用前景十分廣闊，但同時在生產實踐中也有其固有的局限性：①由于缺少常規育種各個分離世代遺傳基因的交換重組，無法分離積累更多的優良基因型，不能有效打破不良基因連鎖；②誘導系材料不足且誘導率不穩定，與不同基因型母本材料雜交誘導后差異顯著；③誘導率低，可能是受到親本遺傳背景、種植環境、溫度等因素的影響；④加倍率低，研究認為秋水仙素的處理濃度和時間與加倍率成正比，但與成活率成反比。為克服以上困難首先需要創制出適應當地生態條件的優良誘導系，在應用該育種技術時還需合理選擇優良互補基因型親本，快速有效地聚合有利基因，同時在適宜的環境和條件下種植以提高誘導率，并將人工處理溫度、時間和試劑濃度合理配比，探索出適應特定組合的最佳加倍途徑，將加倍得到的雙單倍體種子在田間精密播種，妥善管理，通過植株長勢、形狀、籽粒色澤對雙單倍體進行確認，將得到的DH系根據育種需要以去劣為原則進一步選擇利用，同時與其他育種手段相結合以更好地應用于生產實踐。

目前國內單倍體誘導育種技術主要是在普通玉米上利用，在鮮食玉米甜玉米、糯玉米、甜糯玉米上的利用研究相對較少，可供參考的文獻和數據也比較匱乏。呂桂華[32]研究發現糯玉米和普通玉米材料誘導率高于甜玉米。李高科[33]通過Stock6與甜玉米雜交誘導后，在24 ℃條件下用0.02%秋水仙素浸泡種子32 h，成功獲得了DH系，并用SSR標記對其純度進行了鑒定。以上研究表明將單倍體技術應用于鮮食玉米具有可行性。運用該育種方法指導鮮食玉米的育種實踐，能顯著提高鮮食玉米材料創制過程中的準確性，為鮮食玉米雙(多)隱性材料的創制提供一種新途徑，符合改良鮮食玉米品質需求的發展趨勢。然而同一單倍體誘導系分別與甜玉米、糯玉米、甜糯玉米雜交后的誘導率是否存在差異、哪種誘導系在鮮食玉米上的誘導效果更好、遺傳標記基因在不同的鮮食玉米材料中顯色程度如何、如何更好地提高鮮食玉米單倍體的加倍效果等問題都是目前亟需解決的，未來還需努力探索形成單倍體技術在鮮食玉米利用的新體系，以發揮單倍體技術在鮮食玉米育種中的利用優勢。

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Utilization and Development Prospect of Haploid Breeding Technology in Maize

SONG Qiao-heng, YANG Yue-hua, KONG Liang-liang et al

(Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Deyang, Sichuan 618000)

AbstractWe introduced the application advantage of haploid technology in maize breeding, induced mechanism and genetic regularity of haploid, necessary link for haploid breeding technology of maize, and the utilization status in China. At the same time, the limitations and difficulties of haploid technology application were discussed. The possibility of using this technology in the breeding of fresh edible maize was forecasted.

Key wordsMaize; Haploid technology; Induced breeding; Development prospect

基金項目四川省“十二五”農作物育種攻關甜、糯玉米雜交種選育子專題(2011NZ0098-2)；四川省“十二五”財政創新能力提升工程：甜糯玉米種質資源創新及新品種培育(2016ZYPZ-037)。

作者簡介宋俏姮(1989-)，女，四川峨眉山人，研究實習員，碩士，從事玉米遺傳育種研究。

收稿日期2016-02-20

中圖分類號S 513

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-023-03