黃瓜抗霜霉病的分子標記及相關基因的研究進展

張 志，王琪琪，賀 東

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江齊齊哈爾 161601)

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黃瓜抗霜霉病的分子標記及相關基因的研究進展

張 志，王琪琪，賀 東

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江齊齊哈爾 161601)

從黃瓜霜霉菌的病原菌和發病特點、發病規律、影響發病的因素、分子標記、抗霜霉病基因相關的分離、鑒定等方面綜述了黃瓜抗霜霉病的相關分子生物學領域的研究進展，并對今后的研究方向進行了展望。

黃瓜霜霉病；基因；分子標記；克隆

霜霉病是世界上危害瓜類作物的主要葉部病害之一，黃瓜霜霉病(Cucumber downy mildew)是危害70多個國家黃瓜生產的一種世界性病害。霜霉病是包括白粉病、枯萎病在內的三大病害之一。黃瓜霜霉病是由真菌門鞭毛菌亞門古巴假霜霉菌侵染引起的一種世界性病害，在適宜條件下，葉片發黃、枯死，病情發展迅速，產量虧損嚴重，給黃瓜生產帶來巨大威脅。近年來，關于黃瓜抗霜霉病的分子生物學研究日益增多，在抗病基因分離、鑒定、分子標記等方面取得了一定進展。筆者對黃瓜抗霜霉病的分子標記及相關基因的研究進展進行綜述，并對今后的研究方向進行了展望。

1　霜霉病的病原菌和發病特點

1.1病原菌古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubnsis(berk.etCurt.)Rostov)是一種專性寄生菌，屬于鞭毛菌亞門霜霉菌目和假霜霉屬。病菌的孢子囊梗無色，從氣孔伸出，單生或2～4根束生，上部呈3～5次銳角分枝，分枝末端著生一個檸檬形或卵形孢子囊，孢子囊可釋放出游動孢子或萌發長出芽管，變為圓形休止孢子，萌發芽管，侵入寄主，產生孢子囊適宜溫度15～20 ℃，萌發適宜溫度15～22 ℃[1]。

1.2發病特點霜霉病侵染以葉片為主。苗期發病，子葉上起初出現褪綠斑，不規則形狀，且病斑逐漸呈黃色，隨著病情發展子葉很快變黃，枯干；成株期發病，葉片上初現淺綠色水浸斑，擴大后黃綠色轉淡褐色，呈多角形，后期病斑匯合成片，由葉緣向上卷縮，全葉干枯，嚴重時全株葉片枯死[2]。2個時期潮濕時均生出灰黑色霉層于葉背面病斑上。

2　發病規律

氣流和風雨是霜霉病菌孢子進行傳播的主要媒介，且對空氣濕度要求較高，棚內有結露，葉面有水滴是發病的必要因素。葉片上有水滴，15 ℃下孢子囊經1.5 h即可萌發，游動孢子2.0 h即可萌發侵入引起發病，在形成病斑后，空氣濕度與孢子囊形成的速度和數量成正比，在葉面有水滴和飽和濕度的條件下，隨著寄主葉組織充水，病斑發展加劇，可產生大型的孢子囊，否則孢子囊不能萌發，且2～3 d后即喪失萌發能力，霜霉病發病的適宜溫度是15～24 ℃，低于15 ℃或高于28 ℃不易發病，溫度越高，越不易發病[3]。

3　影響發病的因素

3.1品種間抗病性、種植環境黃瓜品種間發病有差異。一般情況下，較為感病的品種熟性較早、耐低溫，相對較抗病的品種較晚熟、耐熱性強。地勢較高、排水良好的地塊適宜黃瓜種植，同時施足底肥，合理追施氮、磷、鉀肥，可降低霜霉病的發病概率。

3.2光照、溫度和濕度在光照與黑暗交替的環境條件下產生孢子最多，而在持續光照下，幾乎無孢子囊產生[4]。黃瓜霜霉病屬于高濕病害，孢子囊在葉面有水滴或水膜時才能萌發，石延霞等[5]研究表明，葉片接種病菌后保濕2 h可引起發病，病菌侵入寄主后，環境濕度條件對病害的發展影響不大。Cohen等[6]研究發現，孢子囊產生和侵染的適宜溫度為15～20 ℃。

3.3顯癥天數與產孢潛能的關系研究發現，顯癥后天數與累積孢子囊量之間呈拋物線型相關，活體葉片單位面積上產生的孢子囊量比離體葉片多[7]。且顯癥后天數與累積孢子囊量、病斑面積間存在較高相關性[6-9]。

4　黃瓜抗霜霉病基因分子標記的研究

黃瓜基因組較小，約為3×105kb。Kennard等[10]報道了2個與黃瓜抗霜霉病基因連鎖的RFLP標記CsC230/EcoRI和CsC593/DraI，與抗性基因的遺傳距離分別為9.5和17.7 cM。Horejsi等[11]鑒定出一個與控制霜霉病基因dm緊密連鎖的RAPD標記BC5191100，遺傳距離為9.9 cM。丁國華等[12]以L18-10-2(感霜霉病黃瓜)和129(抗霜霉病黃瓜)為親本構建F2代分離群體，獲得了一個與霜霉病抗病基因緊密連鎖的RAPD標記SBSP18561，其與抗性基因的遺傳距離為7.85 cM，并將該RAPD標記轉化成SCAR標記SSBSP18494。但上述研究的分子標記與黃瓜霜霉病抗性基因間的遺傳連鎖距離均較遠，劉苗苗[13]構建了8個連鎖群，包括39個標記，總長度為287.4 cM，平均圖距為7.37 cM，每個連鎖群的標記數為2～11個，共定位到5個QTLs(dm1.1、dm3.1)，貢獻率最大為19.6%。趙振國[14]獲得了與ILDM10-4抗性基因(ILdm)連鎖的3個SSR標記：SSR00772、SSR03529、SSR15321，它們與目標基因的遺傳距離分別為3.8、6.0、16.7 cM，其中，標記SSR00772的遺傳距離小于5 cM，可用于分子標記輔助選擇育種，3個標記位于抗霜霉病基因兩側，為其精細定位及圖位克隆奠定了基礎。孟攀奇等[15]采用BSA法篩選到1個AFLP引物組合P11M70，其在抗病池和感病池間表現為多態性，抗病池和抗病親本均具有大小約304 bp的特異譜帶，感病池和感病親本均擴增出大小約為301 bp的特異片段，經F2單株驗證及連鎖分析，該特異片段與霜霉病抗病相關基因相連鎖，連鎖距離為5.22 cM。

5　黃瓜抗霜霉病相關基因的研究

對于抗霜霉病基因的克隆，目前通常以獲得抗病基因同源序列(RGA)為入口，根據抗病基因間相似序列設計簡并引物，從植物基因組中得到的擴增產物與抗病基因緊密連鎖，有較高的同源性[16]。

李建武[17]采用SSH技術構建了富集黃瓜霜霉病抗性相關基因的正、反向差減文庫，應用反向Northern斑點雜交技術進行篩選，從正、反向差減文庫中分別得到了60和26個非重復序列片段(singleton ESTs)，其中，正向差減文庫的singleton ESTs涉及12種功能類別和未知功能，比較分析發現，反向差減文庫與正向差減文庫相比，下調顯著表現在有更多的能量代謝和次級代謝相關基因，說明在霜霉病病原菌脅迫下，黃瓜參與次級代謝和能量代謝基因的表達更多地受到了抑制或破壞。

劉大軍[18]利用SSH技術構建抗病黃瓜材料接種霜霉病菌和未接種差異表達的消減cDNA文庫。經反向Northern blot雜交檢測，共得到48個陽性克隆、14個UniESTs，包括8個singletons和6個contigs，找到了與之匹配的同源序列有10個EST片段，推測其余未找到同源序列的EST片段可能是新基因，RT-PCR，試驗和實時定量RT-PCR，結果表明，Csa001907和Csa002921在抗病品種中有可能是黃瓜抗霜霉病的R基因，證明了大部分R基因是組成型表達的，且在抗病品種中存在下調表達現象，通過實時定量RT-PCR試驗表明，Csa001907和Csa002921在感病品種中不存在下調表達現象。劉大軍等[19]研究發現，在黃瓜基因組中與擬南芥抗霜霉病基因存在185個同源R基因，有2個與甜瓜的抗霜霉病基因At1和At2同源的R基因，通過聚類分析將這些基因分為6類，初步認定Csa001907和Csa002921為黃瓜抗霜霉病的R基因，且在葉片組織中有一定表達量，其表達量減少可引發黃瓜品種的抗病反應。

李佩芳[20]采用實時熒光定量PCR，以EF1-α和UBI-ep為內標基因，探討黃瓜抗霜霉過程與相關抗性基因的關系，發現抗病自交系HNAU-0023防御基因PR-1、MT、PIP、Danj和CAT，信號轉導因子MAPK1，轉錄因子TR、WRKY60、TF和WRKY30相較于感病自交系IL112，表現為上調表達，表明這些基因在一定時間段可能參與了黃瓜過敏性抗病反應，GNRF可能未參與黃瓜過敏性抗病反應，噴施胼胝質抑制劑DDG和H2O2抑制劑DPI/DMTU 6 h后接種霜霉病菌，相較于清水對照，抗病自交系HNAU-0023的防御基因PR-1、PIP和MT，轉錄因子TR、TF、WRKY60、WARKY30和MYC，信號轉導因子RBOH和MAPK1表現為下調表達，說明抑制劑DPI/DMTU/DDG可有效地抑制前期高效上調表達抗性基因下調表達，同時證實這些抗性基因參與了過敏性抗病反應，可能是黃瓜抗霜霉病過程中的關鍵調控基因。

劉大軍等[21]分析了SSH-EST代表的基因功能，發現葉綠體的重建和保護機制和抗氧化脅迫能力與抗病品種抗病能力密切相關，同時，提出可能參與了R基因介導的防御反應有SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰順反異構酶，R蛋白的“保衛靶”可能是smHSP，負責監測細胞內的異常，該發現提供了關于揭示活性氧機制和R基因介導的防衛機制之間關系的關鍵證據。李曉輝[22]通過qRT-PCR分析結果表明，黃瓜抗病品種HNAU-0023離體葉片在接種霜霉病菌48和72 h后CsFBXL基因的表達量顯著下調，而在誘導24 h時感病自交系112顯著上調表達，這暗示CsFBXL基因具有組織特異性表達的同時可能對黃瓜霜霉病過敏性抗病反應存在負調控，在不同激素(ABA、SA、JA)誘導下，前期表達量均較弱，CsFBXL基因在24 h時在ABA、SA誘導下顯著表達，JA的表達量次于二者，因此，推測ABA、SA、JA激素誘導的信號轉導調控可能有黃瓜泛素CsFBXL基因的參與。

目前，實時熒光定量PCR應用廣泛，定量極微量的基因表達或DNA拷貝數通過此技術與其他分子生物學技術相結合成為可能，且熒光定量PCR技術、熒光標記核酸化學技術和寡核苷酸探針雜交技術的應用發展，使定量PCR技術在臨床疾病的診斷和治療方面可能有幫助。SSH是結合了抑制性PCR和消減雜交技術的快捷、有效的差異基因篩選方法，比傳統的DD-PCR、SAGE及cDNA-RNA等技術假陽性低、低豐度mRNA富集效率高、靈敏度高、重復性好等，廣泛應用于動植物發育與分化、微生物基因分型差異、疾病易感性差異、病理和正常樣本方面的抗藥性差異和組織差異的研究。

6　問題與展望

6.1增加分子標記類型，加速優良新品種的選育進程在抗病基因的分子標記方面雖達到了理想距離，但目前用于黃瓜遺傳與育種研究中的分子標記主要是SSR、AFLP和RAPD標記，與其他植物相比，獲得的分子標記類型相對較少。為加速黃瓜優良新品種的選育進程，擴展黃瓜種質資源的遺傳多樣性和重視黃瓜基因表達及調控等方面的研究，克隆主要經濟性狀基因并開發相關廉價快捷的分子標記方法非常必要。

6.2培育高抗黃瓜霜霉病品種應用于實際生產在黃瓜抗霜霉病基因方面，對于抗霜霉病相關基因的功能驗證方面相對復雜，研究相對較少，篩選更為精確的黃瓜抗霜霉病相關基因、利用其優化黃瓜遺傳轉化體系是黃瓜抗霜霉病研究的重點和難點，分離黃瓜抗霜霉病相關基因，利用分子育種手段培育高抗黃瓜霜霉病品種，打破效率和成本因素，應用于實際生產中，是黃瓜霜霉病分子生物學研究的實際目標。

[1] 楊景娟.保護地黃瓜霜霉病發生特點及綜合防治措施[J].安徽農學通報，2012(4)：47-48.

[2] 高屹.黃瓜霜霉病與靶斑病發生原因及防治措施[J].農民致富之友，2014(1)：49.

[3] 張耀莉.黃瓜霜霉病及其綜合防治[J].園藝與種苗，2015(4)：62-63.

[4] COHEN Y，ROTEN J.The relationshop of sporulationt ophotosyntesis in some obligatory and facultative parasites[J].Phytopathology，1970，60(1)：1600-1603.

[5] 石延霞，李寶聚，劉學敏.黃瓜霜霉病菌侵染若干因子的研究[J].應用生態學報，2005，16(2)：257-261.

[6] COHEN Y，ROTEN J.Field and growth chamber approach to epidemiology ofPseudoperonosporacubensiscucumbers[J].Phytopathology，1971，61(6)：736-737.

[7] SALEHI F，LACROIX R，WADE K M.Effects of learning parameters and data preset ation on the perf ormance of backpropagation networks in milk yield prediction[J].Trans ASAE，1998，41(1)：253-259.

[8] 石延霞，李寶聚，劉學敏.黃瓜霜霉病研究進展[J].東北農業大學學報，2002，33(4)：391-395.

[9] SURVILIEN E，SIDLAUSKIENC A.Investigation of fungicides efficiency to control downy mildew(Pseudoperonosporacubensis(Bert.et Curt.)Rostow.)in cucumber[J].Hort Veg Growing，1999，18(3)：250-255.

[10] KENNARD W C，POETTER K，DIJKHUIZEN A，et al．Linkages among RFLP，RAPD，isozyme，disease-resistance，and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber[J]．Theor appl genet，1994，89：42-48.

[11] HOREJSI T，STAUB J E，THOMAS C．Linkage of random amplified polymorphic DNA markers to downy mildew resistance in cucumber(CucumissativusL.)[J]．Euphytica，2000，115(2)：105-113.

[12] 丁國華，秦智偉，周秀艷，等.黃瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR標記[J].西北植物學報，2007，27(9)：1747-1751.

[13] 劉苗苗.黃瓜霜霉病、白粉病抗病基因的QTL定位[D].哈爾濱：東北農業大學，2010.

[14] 趙振國.黃瓜-酸黃瓜抗霜霉病漸滲系分子標記的篩選及細胞程序性死亡相關基因的表達分析[D].南京：南京農業大學，2011.

[15] 孟攀奇，蔡麗靜，張桂華，等.與黃瓜霜霉病抗性相關基因連鎖的分子標記研究[J].長江蔬菜，2014(8)：12-14.

[16] 丁國華．黃瓜抗病基因同源序列的克隆及其對霜霉病抗病基因標記的研究[D]．哈爾濱：東北農業大學，2004.

[17] 李建武.黃瓜霜霉病抗性相關基因篩選及過敏性抗病機制[D].武漢：華中農業大學，2010.

[18] 劉大軍.黃瓜霜霉病抗病基因鑒定及其表達分析[D].哈爾濱：東北農業大學，2013.

[19] 劉大軍，秦智偉，周秀艷，等.黃瓜基因組中抗霜霉病候選基因的生物信息學及其表達特異性[J].中國農業科學，2013，46(19)：4066-4074.

[20] 李佩芳.黃瓜霜霉病過敏性反應的研究[D].鄭州：河南農業大學，2013.

[21] 劉大軍，秦智偉，周秀艷，等.利用SSH技術鑒定黃瓜抗霜霉病相關基因[J].中國蔬菜，2014(1)：17-23.

[22] 李曉輝.黃瓜泛素E3連接酶基因的克隆及表達分析[D].鄭州：河南農業大學，2014.

New Progress in Molecular Markers and Related Genes of Cucumber Downy Mildew

ZHANG Zhi, WANG Qi-qi, HE Dong

(College of Life Sciences and Agriculture and Forestry, Qiqihar university, Qiqihar, Heilongjiang 161006)

Research progress of the molecular biology of cucumber downy mildew was reviewed from the aspects of the characteristics, occurrence regularity, molecular marker, pathogen of cucumber downy mildew, related isolation and identification of downy mildew gene. The direction of future research was forecasted.

Cucumber downy mildew; Gene; Molecular marker; Cloning

黑龍江省教育廳科學技術研究項目“鉀對高寒地區設施黃瓜生長影響的研究”(11551538)。

張志(1966- )，男，黑龍江海倫人，副教授，碩士，從事生物遺傳學方面的研究。

2016-05-26

S 436.421.1+1

A

0517-6611(2016)18-120-03