人狂犬病病例的實驗室診斷技術及應用原則

種世桂，趙玉敏

（桂林醫學院，廣西 桂林 541004）

人狂犬病病例的實驗室診斷技術及應用原則

種世桂，趙玉敏

（桂林醫學院，廣西 桂林 541004）

我國是狂犬病疫情最嚴重的地區之一，在世界范圍內年報告死亡人數僅次于印度。雖然近年狂犬病報告病例數逐年下降，但疫區不斷擴大。我國的人狂犬病病例報告大部分基于臨床癥狀及病例的流行病史，基于實驗室診斷報告的病例為數甚少。而WHO要求狂犬病病例報告具有實驗室診斷依據；國家新的監測方案也要求所有報告病例均應進行實驗室檢測?；谝陨媳尘埃疚闹貙θ丝袢〔±膶嶒炇以\斷技術及其應用原則進行綜述，以期為我國今后狂犬病病例的監測及實驗室診斷提供借鑒。

人狂犬病病例；狂犬??；狂犬病毒；實驗室診斷

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染引起的人獸共患烈性傳染病，屬于中華人民共和國乙類法定報告傳染病，病死率將近100%。我國狂犬病病例大多是依據動物咬傷史和典型的臨床表現而確定的臨床診斷病例，實驗室診斷病例相當有限。隨著循證醫學的發展，實驗室診斷的地位日益突出。一方面，狂犬病潛伏期長短的不確定（幾周到幾年不等）、與其他腦炎在臨床表現上具有相似性，極易誤診或漏診。另一方面，按照WHO對于疾病診斷的要求，狂犬病病例的診斷除傳統的由癥狀、病史作出臨床診斷外，其確診更應依賴于實驗室進行的病原學診斷，以及時正確進行暴露后患者的針對性處理及帶毒動物的處置，避免狂犬病的進一步播散。因此，在條件允許的情況下，所有可能或者疑似的臨床狂犬病病例都要用實驗室方法進行確診。本文主要介紹了目前應用于人狂犬病例診斷的實驗室診斷方法及其應用原則，并比較了各自的優缺點，為人狂犬病病例的早期診斷和深入研究以及進一步的預防和控制提供理論基礎。

1　狂犬病病例的診斷

根據《狂犬病診斷標準（WS281-2008）》，同時參考世界衛生組織《狂犬病咨詢報告（第二版）》中實驗室檢測方法，臨床診斷為腦炎的病例都要引起警覺；若條件允許，所有狂犬病可疑病例都要用實驗室方法進行證實?？袢〉呐R床定義：病例具有急性神經綜合癥 （如腦炎），主要表現為過動綜合征（如狂躁型狂犬?。┗蛘呗楸跃C合征（如早癱性狂犬?。瑵u漸發展為昏迷或死亡。如果沒有重癥監護，病人通常會在首發癥狀出現后7～11d內死于循環或呼吸衰竭［1］。

2　人狂犬病實驗室診斷技術

狂犬病病毒的特異性檢測是確診的必要條件，建立并普及特異性檢測技術對該病是預防和診治都有重要意義?？袢〔《景w的特異性不強，與其它疾病易于混淆，通過觀察中樞神經系統神經元胞漿內的包涵體、內基式小體的組織病理學方法已經很少在世界各地應用。目前我國狂犬病例實驗室診斷常用的技術包括DFA、RFFIT、RT-PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR等等。

2.1熒光抗體試驗（FluorescentAntibody Test，FAT）

熒光抗體試驗（FAT）［2］是通過狂犬病病毒抗原的單克隆抗體或者多克隆抗體來檢測樣本中狂犬病病毒的方法。DFA是狂犬病毒抗原檢測的金標準，是狂犬病實驗室診斷最快速、最可靠的方法［3］，其原理為：感染狂犬病毒的細胞攜帶的狂犬病毒抗原，可以特異性地與FITC標記的抗狂犬病毒單克隆抗體相結合，在顯微鏡下可以直接觀察到的FITC的可見熒光了解到抗原抗體之間的特異性反應。陽性結果表明狂犬病毒感染，有確診意義［4］。該法可檢測新鮮病料、甲醛固定的標本或甘油保存的樣品，也可檢測臨床狂犬病人的皮膚活檢物或毛囊，甚至是冰凍幾小時內的皮膚活組織或角膜印片中的病毒抗原［5］。

2.2酶聯免疫吸附試驗（enzyme1inkedimmunosorbentassay，ELISA）

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）主要根據抗原抗體結合反應實現檢測目標，不僅能評估動物免疫水平，還可用于檢測腦組織中狂犬病病毒核衣殼蛋白。應用在狂犬病的診斷方面主要依賴狂犬病毒抗原進行，ELISA檢測狂犬病抗原是PerrinP于1986年建立的，通過使用抗狂犬病毒特異性單克隆抗體包被塑料板，與標本中的待檢抗原結合，其中待檢抗原又與后加入的辣根過氧化物酶標記抗狂犬病毒單克隆抗體特異性結合，再通過辣根過氧化物酶與底物作用產生可見的顏色反應，最終達到檢測目的。其顯色程度與待檢抗原含量呈正相關［4］。

2.3快速狂犬病酶免疫診斷法（rapidrabiesenzy meimmunodiagnosis，RREID）

快速狂犬病酶免疫診斷法（RREID）是一種簡單的常規診斷狂犬病的快速酶免疫診斷技術，也是WHO推薦的抗原檢測方法，通過檢測腦組織中的狂犬病病毒核蛋白來診斷狂犬病。

2.4快速熒光灶抑制試驗（rapid fluorescentfocus inhibition test，RFFIT）

快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）是WHO狂犬病專家委員會推薦的檢測狂犬病病毒中和抗體的標準方法［1］，是以熒光灶為指示系統的血清中和試驗。通過將待測血清與攻擊病毒進行中和反應后，接種體外細胞，用熒光抗體試驗（FAT）檢測剩余病毒從而計算中和抗體效價［2，15，16］。試驗中應盡量減小樣品的污染；冷丙酮固定-20℃較-4℃效果要好，固定時間應大于10min，最好能達到半個小時；試驗完成后盡快鏡檢以防熒光信號淬滅影響結果。RFFIT可以在24h內檢測出抗體水平，除了應用于狂犬病疫苗接種者血清中和抗體水平檢測外，還可應用于動物接種試驗、細胞培養基礎上的中和試驗、抗狂犬病病毒糖蛋白抗體檢測試劑盒的評估、中和性單克隆抗體的鑒定和評價以及被動免疫制劑的效能評估等方面。RFFIT實驗步驟繁瑣，實驗試劑及儀器要求較高，對實驗操作人員要求高，其檢測結果受到操作人員的熟練程度及主觀判定因素、病毒種子的質量、標準血清和樣品的質量、抗體濃度以及實驗對照系統情況等因素影響。

2.5熒光抗體病毒中和試驗（fluorescentantibody virus neutralization test，FAVNT）

熒光抗體病毒中和試驗（FAVNT）是OIE認定的狂犬病抗體檢測標準方法，目前在WHO和OIE狂犬病參考實驗室中應用較廣［21］。FAVNT也是一種抗原抗體中和反應試驗方法，將一定量的血清與狂犬病毒CVS（適應細胞培養的標準攻毒毒株）在體外中和，然后接種對狂犬病病毒敏感的細胞，血清稀釋度能100%中和病毒，且當血清滴度在50%以上就有中和病毒的能力。該試驗對血清質量要求較高，細胞對毒素太敏感，血清內所含毒素較多可導致假陽性的發生。FAVNT敏感性、特異性強，可進行較大樣本的檢測，但其操作過程較復雜，所需時間較長（至少一天），通常僅作為輔助診斷方法而不作為常規方法。

2.6PCR（Polymerse Chain Reaction，PCR）檢測技術

聚合酶鏈反應（PCR）是1983年Millis發明的一種核酸體外擴增系統，以雙鏈DNA分子堿基配對為原則，采用耐熱DNA聚合酶和DNA合成引物，以目的基因為模板在體外特異性擴增DNA片段。PCR技術靈敏度高、診斷快速，適用于大批量樣品的狂犬病毒毒株核酸檢測，還可用于唾液、腦脊液等不適合做DFA的標本。但其對試驗條件、實驗設備、操作人員的要求相當嚴苛，極易造成假陽性或者假陰性。目前，狂犬病病毒核酸的檢測技術只作為狂犬病診斷技術的輔助性或確定性方法。

2.6.1逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）

狂犬病毒為負鏈RNA病毒，PCR擴增前需要先完成逆轉錄、合成第一條cDNA鏈（RT）再進行PCR擴增，即逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerasechainreaction，RT-PCR）。基于這一原理，設計狂犬病毒基因片段特異性擴增引物，將可疑狂犬病人的標本進行核酸提取、特異性擴增和檢測，陽性結果可以明確狂犬病毒感染，確診狂犬?。?］。

2.6.2巢式PCR（nested-PCR）

巢式PCR（nested-PCR）是由普通PCR發展而來的一種PCR技術，是一種常用的檢測狂犬病病毒的分子生物學方法。其原理是設計兩對引物，其中一對引物在另一對引物擴增產物的片段上，通過二次PCR反應對某個基因進行檢測。診斷狂犬病可以通過核苷酸序列測定、RT-PCR產物的多態性分析，或者針對各基因型設計特異性引物進行巢式PCR實現。巢式PCR的靈敏度和特異性比RT-PCR更好，也可作為狂犬病實驗室診斷技術之一。

2.6.3實時熒光定量PCR（Real-TimePCRor qRT-PCR）

實時熒光定量PCR是一種由PCR技術發展而來的檢測技術，在反應體系中加入熒光染料或熒光探針等熒光物質，利用熒光信號實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知起始模板定量分析的方法。該技術實行完全閉管式操作，大大減少擴增產物污染的機會，還具有操作簡單、快速高效、靈敏度高、特異性強、動力學范圍寬及高通量等優點，極大地克服了原有PCR技術的不足，廣泛應用于核酸定量分析中。但由于該技術成本較高，在大部分實驗開展比較困難，短期內難以普及。

3　狂犬病病例實驗室診斷的關鍵步驟

3.1狂犬病實驗室診斷的生物安全

在狂犬病相關工作中，安全至關重要。所有狂犬病診斷及相關工作的參與人員均應事先接種狂犬疫苗并證實已獲得完全性保護 （血清抗體≥0.5IU/mL）。通常，對動物處理、尸體解剖、收集準備品、樣本處理等常規的實驗室活動應在生物安全II級實驗室完成。在某些情況下，如生產大量濃縮病毒、進行會產生氣溶膠的操作（例如同質化的組織懸液）、不清楚當前的預防措施對所接觸的狂犬病病毒防護效果如何，可考慮采用生物安全III級實驗室。應該遵守所有涉及感染性物質工作的國家安全指南。

3　結論與展望

隨著診斷技術的不斷發展進步，我國報告法定傳染病的實驗室診斷率不斷提高，但仍遠遠落后于西方國家的實驗室診斷率。不同的可疑狂犬病病料需要恰當的實驗室方法才能明確診斷。規范化的診斷程序在狂犬病例確診上具有極其重要的作用；快速準確得出狂犬病實驗室診斷結果對病人的暴露后治療、受暴露馴養動物的預防處置至關重要?？袢嶒炇以\斷技術的進一步推廣，我國狂犬病實驗室診斷率的提高，適用于野外和實驗室操作的簡單、特異且敏感的病毒抗原檢測、血清抗體監測及病毒核酸檢測的方法等等，都有待進一步研究。

［1］ WHO expert consultation on rabies.Second report.World Health Organ Tech Rep Ser.2013，（982）：1-139.

［2］ 扈榮良.狂犬病理論、技術與防治［M］.北京：科學出版社，2007.

［3］ Meslin F X，Kaplan M M，Koprowski H.Laboratory techniques in rabies，Fourth edition，WHO，Geneva，1996，88-95.

［4］ 中華人民共和國衛生行業標準：狂犬病診斷標準（WS2 81-2008）［M］.北京：人民衛生出版社，2008.

［5］ 李靜.狂犬病的實驗室診斷在臨床狂犬病診斷中應用的研究［D］.瀘州醫學院，四川：2009.

R-3