毒蛋白A鏈基因被共抑制的蓖麻種子中毒蛋白含量的測定

黃鳳蘭,雷　雪,趙　永,李國瑞,羅　蕊,陳曉鳳,李　躍,孫華軍

(1.內(nèi)蒙古民族大學 生命科學學院,內(nèi)蒙古 通遼　028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,

內(nèi)蒙古 通遼　028000;3.東北林業(yè)大學 生命科學學院,黑龍江 哈爾濱　150036)

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毒蛋白A鏈基因被共抑制的蓖麻種子中毒蛋白含量的測定

黃鳳蘭1,2,雷雪1,3,趙永1,李國瑞1,2,羅蕊1,陳曉鳳1,李躍1,孫華軍1

(1.內(nèi)蒙古民族大學 生命科學學院,內(nèi)蒙古 通遼028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,

內(nèi)蒙古 通遼028000;3.東北林業(yè)大學 生命科學學院,黑龍江 哈爾濱150036)

摘要：為了獲得毒蛋白含量低的蓖麻轉(zhuǎn)基因新材料，以毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的T0、T1、T2種子為研究對象，對種子中的毒蛋白含量進行測定。結(jié)果表明，采用磷酸鹽提取法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法，測定種子中毒蛋白含量，獲得了2個共抑制后穩(wěn)定遺傳的材料，即T2-9-1、T2-15，毒蛋白A鏈含量均為0，毒蛋白B鏈含量分別為對照通蓖5號的77.63%，83.38%。這2個材料可以作為低毒蛋白含量的蓖麻材料進行推廣。

關(guān)鍵詞：蓖麻;毒蛋白;A鏈基因

蓖麻(RicinuscommunisL.)是世界上一種重要的油料作物[1-3]。中國作為世界第二大蓖麻生產(chǎn)國,已有 1400多年的種植歷史,集約化栽培地區(qū)有內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、山西、陜西等省區(qū),蓖麻種子年收購量超過27.5萬t[4]。對蓖麻的研究處于世界領先水平,蓖麻種子榨油后的副產(chǎn)物——蓖麻餅粕占蓖麻種子的50%以上,隨著蓖麻油需求量的增長,也伴隨著產(chǎn)生大量餅粕[5]。因此，對其綜合開發(fā)利用可變廢為寶,創(chuàng)造經(jīng)濟效益,對推動蓖麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的作用[6]。蓖麻餅粕中含有豐富的蛋白質(zhì),粗蛋白含量達33%~35%,為糧食作物的3倍。蓖麻蛋白絕大部分可被動物消化吸收利用[7],因此,開發(fā)蓖麻餅粕作為畜禽蛋白飼料,可充分利用其中的蛋白質(zhì),增加飼料行業(yè)的蛋白質(zhì)資源。但蓖麻餅粕中含有蓖麻堿、毒蛋白、凝集素、變應原等毒素[7-8],而未經(jīng)脫毒的蓖麻餅粕不能直接用于配合飼料。目前,國內(nèi)開發(fā)研究蓖麻餅粕作為畜禽蛋白飼料途徑主要采用物理、化學、微生物方法脫毒[9-10],這些方法消耗大量的人力和能源,限制了蓖麻餅粕的廣泛利用。

蓖麻餅粕所含的毒性物質(zhì)中蓖麻毒蛋白的毒性最強、含量最高。蓖麻毒蛋白相對分子量約 64.0 kDa,由A、B兩條鏈構(gòu)成,其毒性部分A鏈分子量為 32.0 kDa,是一種N-糖苷酶,可失活60S核糖體,導致真核細胞的死亡,是活性鏈;B鏈分子量為 34.0 kDa,是一種半乳糖結(jié)合型蛋白,幾乎可與所有的真核細胞上半乳糖殘基相結(jié)合,是運載體;A、B鏈通過二硫鍵相連[11-12]。曾佑煒等[13]曾測定過蓖麻種子中毒蛋白的含量,Huang等[14]對通遼地區(qū)的蓖麻品種種子中的毒蛋白含量進行了定量測定;趙志強等[15]對蓖麻不同部位葉柄中的毒蛋白含量進行了測定;羅蕊等[16]對蓖麻組培苗不同部位葉片中毒蛋白含量進行了測定;黃鳳蘭等[17]對不同發(fā)育時間蓖麻鮮種子中的毒蛋白含量進行了測定。但是對毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測定的研究尚未見報道。

內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心克隆了蓖麻毒蛋白A鏈基因，采用共抑制技術(shù)，構(gòu)建含有蓖麻毒蛋白A鏈基因的反向重復表達載體，對通蓖5號蓖麻進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了毒蛋白A鏈基因表達被抑制的蓖麻轉(zhuǎn)基因植株。本試驗的目的就是對所獲得的T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因植株種子中的毒蛋白含量進行測定,這將為獲得低毒的蓖麻轉(zhuǎn)基因品種奠定基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

待檢測材料:毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的T0、T1、T2種子;對照材料:通蓖5號蓖麻種子。由內(nèi)蒙古民族大學的內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心提供。

儀器:Eppendorf移液槍,德國;Hema冷凍離心機,珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司;BCD-556WSDH型冰箱,澳柯瑪股份有限公司;BSA224S-CW型電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司;pHS-3C精密pH計,上海精密科學儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠;恒溫干燥箱,精宏有限公司;格蘭仕微電腦-CH2082型電磁爐,中山市格蘭仕生活電器制造有限公司;WD-9406型膠片觀察燈,北京六一儀器廠;漩渦振蕩儀,上海大有儀器;900 SERIES型超低溫冰箱,美國Thermo;紫外分光光度計,上海譜元儀器有限公司。

藥品:磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、氯化鈉(NaCl)、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base)、濃鹽酸(HCl)、過硫酸銨((NH4)2S2O8)、硫酸銨((NH4)2SO4)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸(Gly)、低分子量蛋白分子量標準(非預染,Protein Marker)、冰乙酸(CH3COOH)、乙醇(C2H5OH)、考馬斯亮藍R-250(C47H48N307S2Na)、異丙醇((CH3)2CHOH)、聚乙二醇(PEG8000)、甘油(C3H8O3)、溴酚藍(C19H10Br4O5S)、BCA蛋白定量試劑盒等,均購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司。液氮,購于通遼市通達氣體公司。

試劑:緩沖液A(磷酸緩沖液PBS,含100 mmol/L NaCl,pH=6.5)、30%(m/V)凝膠貯液、10%(m/V)過硫酸銨、1.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.8)、1 mol/L Tris-HCl (pH=6.8)、10%(m/V)SDS、5×SDS-PAGE Loading Buffer、1×Tris-Glycine Buffer、考馬斯亮藍R-250染色液、考馬斯亮藍脫色液。

用具:離心管(100，500，1 000 μL)、研缽、研錘、刀片、MD25 mm透析袋(MW8000-14000)、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、玻璃棒、容量瓶。

1.2試驗方法

1.2.1T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白含量測定毒蛋白A鏈基因被共抑制的T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白的提取、蛋白標準曲線的制作、粗蛋白濃度的測定、粗蛋白含量的計算,均參照黃鳳蘭等[17]對不同發(fā)育時間蓖麻鮮種子中毒蛋白含量的測定方法進行。

1.2.2T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測定粗蛋白的SDS-PAGE電泳、毒蛋白條帶灰度百分比分析、毒蛋白含量的計算與分析,均參照黃鳳蘭等[10]對不同發(fā)育時間蓖麻鮮種子中毒蛋白含量的測定方法進行。

1.2.3數(shù)據(jù)分析用IBM SPSS Statistics軟件,分析T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量、粗蛋白含量、毒蛋白含量的均值、標準誤、差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白含量測定結(jié)果

2.1.1粗蛋白提取結(jié)果毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量和得到的粗蛋白體積見表1。

從表1可以看出,單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量和得到的粗蛋白體積與對照通蓖5號相比,均在0.01水平上,差異顯著。單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種子質(zhì)量波動范圍分別為0.275 4~0.281 6，0.276 6~0.286 7，0.284 5~0.289 1 g;T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種仁質(zhì)量波動范圍分別為0.206 6~0.211 2，0.207 5~0.215 0,0.213 4~0.216 8 g。

表1　轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白提取結(jié)果

注：數(shù)據(jù)采用Duncan新復極差法進行均值和標準差的計算，不同字母表示在1%水平上顯著性差異。表2,4同。

Note:The data use Duncan′s new multiple range method to count the mean and the standard deviation.Different letters mean significant difference at 1% level.The same as Tab.2,4.

2.1.2蛋白標準曲線的制作結(jié)果根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明,得出濃度計算公式:C=k1×(Abs)+k0,其校正方法為濃度法,k0=-0.080 91,k1=0.982 79,相關(guān)性為0.999 7,測量波長為562.0 nm。從GeneQuant 1300儀器上得出的蛋白標準曲線見圖1。從圖1可以看出,所制作的蛋白標準曲線能達到要求。

2.1.3粗蛋白含量測定結(jié)果毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白稀釋100倍后測定的Abs值、根據(jù)蛋白標準曲線折算出稀釋100倍后粗蛋白的濃度,計算出蓖麻種子中粗蛋白的含量,見表2。

從表2可以看出:單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子的粗蛋白含量與對照通蓖5號相比,均在0.01水平上,差異顯著。單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子的粗蛋白含量波動范圍分別為2.901 3~3.540 1，3.110 4~3.713 2,3.496 3~3.587 7 mg。

圖1　蛋白標準曲線

樣品編號SampleNo.稀釋100后Abs/(μg/μL)Diluted100rearAbs稀釋100倍后濃度/(μg/μL)Afterthe100timesdilutedconcentration粗蛋白含量/mgThecontentofcrudeproteinofaseedT0T0-90.1223±0.0006B0.0393±0.0002B3.5401±0.0098BT0-150.1176±0.0013A0.0347±0.0003A2.9013±0.0004A通蓖5號0.1783±0.0011C0.0943±0.0017C9.4394±0.0015CT1T1-9-10.1254±0.0014B0.0423±0.0017B3.6880±0.0133BT1-9-40.1252±0.0009B0.0421±0.0007B3.7132±0.0007BT1-150.1198±0.0008A0.0369±0.0006A3.1104±0.0061A通蓖5號0.1781±0.0018C0.0941±0.0016C9.3746±0.0118CT2T2-9-10.1241±0.0010A0.0411±0.0007A3.4963±0.0086AT2-150.1249±0.0014A0.0419±0.0009A3.5877±0.0019B通蓖5號0.1773±0.0005B0.0933±0.0006B9.4520±0.0075C

2.2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測定結(jié)果

2.2.1粗蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白SDS-PAGE電泳,結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出,電泳結(jié)果清晰,可被用于BandScan蛋白定量分析軟件進行分析。

M.蛋白Marker;A:1.T0-9,2.T0-15,3.通蓖5號;B:1.T1-9-1,2.T1-9-4,3.T1-15,4.通蓖5號;C:1.T2-9-1,2.T2-15,3.通蓖比5號。

2.2.2蛋白條帶灰度分析毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白SDS-PAGE電泳后,每種蛋白條帶的灰度值用BandScan蛋白定量分析軟件進行分析的結(jié)果見圖3,種子中每種蛋白灰度測定結(jié)果見表3。

圖3　T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白中每種蛋白質(zhì)灰度分析

條帶序號StripsNo.T0T1T2MarkerT0-9T0-15通蓖5號Tongbi5MarkerT1-9-1T1-9-4T1-15通蓖5號Tongbi5MarkerT2-9-1T2-15通蓖5號Tongbi5171595721201181171041051051031111111123139139136121123123120132134132416214614616351921772016206179178214215721518923082352092459242212263102592283081130931131026631431431512330269340132712732721428015290總灰度值Totalgrayvalue754799449160966064697984914147278027601622

從圖3、表3可以看出:T0-9的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為311;T0-15的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為0;對照通蓖5號的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為330,B鏈條帶灰度為310。T1-9-1的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為273;T1-9-4的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為280,B鏈條帶灰度為269;T1-15的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為266;對照通蓖5號的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為290,B鏈條帶灰度為272。T2-9-1的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為314;T2-15的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為314;對照通蓖5號的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為340,B鏈條帶灰度為315。

2.2.3毒蛋白含量測定結(jié)果根據(jù)BandScan蛋白定量分析軟件的3次分析表明,得到單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量占粗蛋白含量百分比,并計算出種子中的毒蛋白含量,結(jié)果見表4。

從表4可以看出,T0-9、T1-9-1、T2-9-1對應的材料在3個世代中毒蛋白A鏈的含量均為0,共抑制后穩(wěn)定遺傳;T1-9-4對應試料在T1毒蛋白A鏈的含量不為0,共抑制后不穩(wěn)定遺傳,所以沒有進行T2的檢測;T0-15、T1-15、T2-15對應的材料在3個世代中毒蛋白A鏈的含量均為0,共抑制后穩(wěn)定遺傳。到T2，T2-9-1、T2-15這2個材料毒蛋白A鏈的含量均為0，并且B鏈含量比對照通蓖5號低，分別為通蓖5號B鏈含量的77.63%(4.773 9/6.149 4)、83.38%(5.127 6/6.149 4)，因此T2-9-1、T2-15這2個材料可以作為低毒蛋白含量的蓖麻材料進行推廣。

表4　轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測定結(jié)果

3結(jié)論與討論

蓖麻是一種重要的油料作物，種子中含有毒素物質(zhì)，限制了餅粕的廣泛利用，其中蓖麻毒蛋白的毒性最強含量最高。本實驗以毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的種子為研究對象，利用磷酸鹽提取法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法，測定T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因植株種子中毒蛋白含量，為獲得毒蛋白含量低的蓖麻轉(zhuǎn)基因新材料奠定基礎。試驗結(jié)果如下：獲得了2個共抑制后穩(wěn)定遺傳的材料，即T2-9-1、T2-15，毒蛋白A鏈含量均為0，毒蛋白B鏈分別為對照通蓖5號的77.63%,83.38%，這2個材料可以作為低毒蛋白含量的蓖麻材料進行推廣。

本試驗所用材料是毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的種子，該種子的種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量均比對照通蓖5號的值要低，主要原因是毒蛋白A鏈基因不表達、B鏈基因表達量也降低，使得種子內(nèi)的總蛋白含量減少，進而使得種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量降低。與黃鳳蘭、雷雪等[17-18]在對不同發(fā)育時間蓖麻鮮種子和單粒蓖麻種子中毒蛋白含量的測定研究中相同，測定的也是單粒蓖麻種子中毒蛋白的含量，所以在試驗操作過程中，應盡量減小誤差，可通過種子充分研磨、盡量收集研缽和研錘上的蛋白質(zhì)、充分溶解蛋白質(zhì)、硫酸銨沉淀完全等方式進行。對單粒蓖麻種子中毒蛋白含量進行測定時粗蛋白的提取過程，必須要比從大量蓖麻種子中提純蓖麻毒蛋白時粗蛋白的提取過程更加嚴格[19-21]。

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Determination of Toxic Protein Ricin a Chain Gene was Co-suppression of Seed Poisoning Protein Content

HUANG Fenglan1,2,LEI Xue1,3,ZHAO Yong1,LI Guorui1,2,LUO Rui1,CHEN Xiaofeng1,LI Yue1,SUN Huajun1

(1.School of Life Science,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028000,China 2.Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor,Tongliao028000,China;3.School of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin150036,China)

Abstract：The purpose of this experiment was to a chain gene toxic protein was co-suppressed in transgenic castor plants T0,T1,T2seeds were determination of toxic protein content,obtain a low content of toxic protein ricin new transgenic material to lay the foundation.The results were as follows:we used phosphate extraction method,BCA kit method,UVwin5,ultravioletV5.1.0,BandScan protein quantitative analysis.,after obtained the two co-suppression stable genetic material,nameed T2-9-1,T2-15,A chain toxin protein content were 0.Contrast Tongliao 5 ricin B chain respectively 77.63%,83.38%,both materials could be used as low-toxic protein ricin material to promote.

Key words:Castor;Ricin;A chain gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.005

中圖分類號：S565.5

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0029-06

作者簡介：黃鳳蘭(1973-),女,山東菏澤人,教授,博士,主要從事蓖麻分子育種研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(30760123;31160290;31460353);國家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)項目(201003057);內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校“青年科技英才支持計劃”(NJYT-14-A10);內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導獎勵資金項目(201506)；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”計劃項目(201511)；市校合作項目(SXZD2012018);內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心開放基金項目(BMYJ2011009)

收稿日期：2015-09-14