分子標記Tamyb10D和TaDFR-B的有效性驗證及對小麥抗穗發芽基因型的篩選

王　瑜,王曉麗,孫曉燕,劉進英,楊　燕

(內蒙古農業大學 生命科學學院,內蒙古 呼和浩特　010010)

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分子標記Tamyb10D和TaDFR-B的有效性驗證及對小麥抗穗發芽基因型的篩選

王瑜,王曉麗,孫曉燕,劉進英,楊燕

(內蒙古農業大學 生命科學學院,內蒙古 呼和浩特010010)

摘要：為了比較與小麥穗發芽抗性相關分子標記的有效性以及在白粒小麥品種中篩選出抗穗發芽的基因型材料,選擇已報道的2個與穗發芽抗性相關的標記Tamyb10D和TaDFR-B,對2套白粒小麥試材(78,103份)的穗發芽抗性進行綜合篩選。結果表明:標記Tamyb10D可有效地用于白粒小麥穗發芽抗性篩選,而標記TaDFR-B不適用于白粒小麥品種(系)材料的穗發芽抗性篩選的鑒定。通過分子標記Tamyb10D的篩選結果和發芽指數的評價,結合以前用分子標記Vp1B3的檢測結果,在103份試材中篩選出5份具有高抗穗發芽基因型材料(GI<10%),分別是:閬中白麥子、萬縣白麥子、陪陵須須白麥、川362和小白玉花,其單倍型分別是:Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bc;在另外一套(78份)試材中篩選出10份具高抗有穗發芽基因型材料(GI<10%),分別為西農6028、克群、百農3217、開封124、鄭州742、西昌5762、小偃5號、克壯、許躍6號和武農99,其單倍型均為Tamyb10D/Vp-1Bc。

關鍵詞：小麥;穗發芽;Tamyb10D;TaDFR-B

小麥穗發芽(Pre-harvest sprouting,簡稱PHS)是一種世界性的自然災害,嚴重地影響了小麥的產量。目前,我國北方的大部分白粒小麥品種對穗發芽高度敏感,收獲期遇雨極易引起穗發芽發生而造成重大的經濟損失[1]。小麥穗發芽抗性是一個多基因控制的數量性狀(QTL),并容易受到周圍環境的影響,穗發芽抗性機制復雜且不同品種之間穗發芽抗性機制也有差異,所以筆者很難通過常規手段將所有抗性組分進行聚合[2]。通常通過測定發芽指數(Germination index,GI)來鑒定白粒小麥的穗發芽抗性[3]。籽粒發芽法能直觀地反映由穗發芽造成的損失及危害[4]。但是測發芽指數容易受時間和周圍環境影響,如果用與種子休眠相關的分子標記來篩選小麥種子的休眠特性,就可以直接從基因水平對種子的休眠特性進行篩選,提高了篩選的準確率。

近年來,已發掘出一些與穗發芽或休眠有關的分子標記及QTL[5]。Singh等[6]通過研究小麥QTL定位,開發出分子標記DuPw004。Yang等[7]利用不同穗發芽抗性白粒小麥的休眠基因Vp1基因,在3B染色體中開發出1個與穗發芽抗性相關的分子標記Vp1B3,通過驗證,Vp1B3標記的有效性較高。目前,Vp1B3在白粒小麥中共擴增出5種等位變異類型,分別為TaVp1-Ba、TaVp1-Bb、TaVp1-Bc、TaVp1-Bd和TaVp1-Be,其中TaVp1-Bd在歐洲的小麥品種中分布較廣[8],TaVp1-Be目前檢測只在紅和尚頭品種中存在[9]。Mares等[10]在研究合成籽粒顏色相關基因(Rgene)的機制和功能中,發現1個與小麥種子休眠相關的分子標記Xwmc468。Tamyb10是在發育的籽粒中調控黃酮類化合物生物合成的R基因,位于3A、3B和3D染色體長臂上[11],是類黃酮合成基因的轉錄活化劑[12]。分子標記Tamyb10D是根據Tamyb10-D1基因在白粒小麥中存在與穗發芽抗性相關的序列多態性而開發的分子標記,在白粒小麥材料中能擴增出2種等位變異類型,分別是1 629 bp的片段和非特異性擴增片段,能擴增出1 629 bp片段的類型屬于抗穗發芽類型[13]。紅粒小麥的種皮色素是通過類黃酮生物合成途徑合成的,在這個途徑中,DFR基因參與了花青素的合成。TaDFR-B在紅粒小麥中的啟動子區有8 bp插入的材料屬于抗穗發芽材料,沒有8 bp插入的為感穗發芽材料,CAPS標記TaDFR-B可以有效地篩選出具有穗發芽抗性的紅粒小麥[14]。雖然目前已經開發出許多與小麥穗發芽抗性或種子休眠特性相關的分子標記(或QTL位點),但是大多數的分子標記只在特定的環境和遺傳背景下有效,且開發的分子標記與小麥育種的應用結合不夠完善[15]。

根據分子標記的應用原則,包括多態性高、共顯性、高效性、經濟方便且容易觀察記載等綜合因素考慮,筆者篩選了STS標記Tamyb10D和CAPS標記TaDFR-B,結合以前分子標記Vp1B3的檢測結果在2套白粒小麥品種(系)中進行有效性驗證,并且進一步篩選抗穗發芽的基因型材料,以拓寬抗穗發芽育種的親本資源,為抗性親本的選擇提供理論依據。

1材料和方法

1.1試驗材料

供試材料共181份(表 1,2),分為2個自然群體,其中78份是中國歷史小麥品種(由中國農科院品質資源所提供),發芽指數GI值來源于肖世和等[16]研究值;另一個自然群體是103份廣泛分布于中國冬麥區的白粒小麥品種(系),發芽指數GI值來源于Yang等研究值[17]。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取與標記引物的合成小麥葉片基因組DNA提取采用CTAB法[18]。分子標記Tamyb10D和TaDFR-B的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,引物序列及相關的信息見表3。

1.2.2PCR反應體系擴增條件PCR反應體系為25 μL,包括10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mix(2.5 mmol/L)2 μL、上下游引物各0.5 μL (20 μmol/L)、LATaq0.25 μL(5 U/μL TaKaRa)、模板DNA 1 μL(100 ng),ddH2O補充反應體系至25 μL。

PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,退火1 min(58~64 ℃),72 ℃延伸1 min,35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3數據統計分析

用Excel進行數據統計,用統計軟件IBM SPSS Statistics 19進行方差分析。

2結果與分析

2.1供試小麥品種(系)的穗發芽抗性等級劃分

將參試材料的穗發芽抗性分為4個等級,即高抗穗發芽、中抗穗發芽、中感穗發芽和高感穗發芽,對應的穗發芽率分別為0~10%，10%～30%，30%~60%和60%~100%[19]。

103份白粒小麥材料平均GI值[17]為36%,包括15個高抗穗發芽品種,23個中抗穗發芽品種,53個中感穗發芽品種,12個高感穗發芽品種,分別占總品種數的14.56%，22.33%，51.46%和11.65%(表1)。78份白粒小麥材料平均GI值[16]為33.01%,包括18個高抗穗發芽品種,30個中抗穗發芽品種,14個中感穗發芽品種,16個高感穗發芽品種,分別占總品種數的23.08%，38.46%，17.95%和20.51%。其中金光麥、白駱駝和UC的發芽指數低于1%,屬極抗品種(表2)。

表1　103份白粒小麥品種(系)的穗發芽抗性及3個分子標記擴增產物的分析

表1(續)

注：A、B.2種類型PCR產物;-.沒有PCR產物。表2同。

Note:A,B.Indicates the two types of PCR products,respectively;-.Indicates no PCR product amplified.The same as Tab.2.

表2　78份白粒小麥品種(系)的穗發芽抗性及3個分子標記擴增產物的分析

表2(續)

表3　2個與穗發芽抗性相關的分子標記

2.2STS標記Tamyb10D的檢驗結果

STS標記Tamyb10D共擴增出2種類型的片段,分別是1 629 bp片段(A類型片段),非特異性擴增片段(B類型片段)(表3、圖 1)。在103份材料中,有23份材料擴增出A類型片段,占總材料的22.33%,GI均值為23.02%;80份材料擴增出B類型片段,占總材料的77.67%,GI均值為39.74%。應用SPSS 19軟件中的相關性分析和比較均值法對數據進行分析。結果表明:分別擴增出A片段類型和B片段類型的兩類材料均值差異有統計學意義(R=-0.370,P<0.001)。在103份材料中,分子標記Tamyb10D檢測出具有穗發芽抗性基因型的材料有23份,其中15份材料抗性較強(GI<30%),分子標記Tamyb10D檢測出抗性較強品種的有效率達65%,這15份抗性較強的材料分別是:萬縣白麥子、宜賓白麥子、輝縣紅、歪頭白、女兒麥、榮昌白麥子、洋小麥、永川白麥子、閬中白麥子、禿葫蘆頭、小白玉花、遂寧坨坨麥、陪陵須須白麥、敘永和川362。其中，閬中白麥子、萬縣白麥子、陪陵須須白麥、川362和小白玉花是高抗穗發芽基因型材料(GI<10%)。其單倍型分別是:Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/ Vp-1Bc。

在78份材料中,38份材料擴增出A類型片段,占總材料的48.72%,GI均值為27.31%;40份材料擴增出B類型片段,占總材料的51.28%,GI均值為38.43%。數據分析表明:擴增出A片段類型和B片段類型的兩類材料的均值差異有統計學意義(R=-0.187,P=0.05)。在78份材料中,分子標記Tamyb10D檢測出具有穗發芽抗性基因型的材料有38份,其中29份材料的抗性較強(GI<30%),分子標記Tamyb10D檢測出抗性較強品種的有效率達76%,這29份材料分別是:官村1號、綿陽82-36、泰山1號、西北612、咸農68、內鄉5號、柚子麥、青春2號、陜農17、川484-769、西昌2043-117、躍進5號、寶雞42、鄭州17、內鄉36、鄭州761、西農6028、克群、百農3217、開封124、鄭州742、西昌5762、小偃5號、克壯、大青芒、許躍6號、武農99、UC、白駱駝。其中，西農6028、克群、百農3217、開封124、鄭州742、西昌5762、小偃5號、克壯、許躍6號和武農99是高抗穗發芽基因型材料(GI<10%)。其單倍型均為Tamyb10D/Vp-1Bc。

綜上所述,STS標記Tamyb10D與白粒小麥的穗發芽抗性相關。

1.農大36;2.CA0475;3.濟南16;4.周8425B;5.鳳麥29;6.冀師02-1;7.白芒麥;8.鄭麥004;9.陜213;10.邯5316;11.藁城8901;12.煙輻188;13.徐麥856。

1.Nongda 36;2.CA0475;3.Jinan 16;4.Zhou 8425B;5.Fengmai 29;6.Jishi 02-1;7.Baimangmai;8.Zhengmai 004;9.Shan 213;10.Gan 5316;11.Gaocheng 8901;12.Yanfu 188;13.Xumai 856.

圖1標記Tamyb10D在部分材料中的擴增結果

Fig.1The results of PCR amplification

with the marker Tamyb10D

2.3CAPS標記TaDFR-B的檢驗結果

TaDFR-B在181份材料中共擴增出2種類型片段,分別是534 bp片段(A類型片段),和526 bp片段(B類型片段),說明TaDFR-B在白粒小麥品種的啟動子區也存在8 bp插入和缺失的多態性。8 bp的插入序列形成一個Hinf Ⅰ限制性酶切位點,酶切后形成432,102 bp片段(圖2)。在103份材料中,有63份材料擴增出A類型片段,占總材料的61.16%,GI均值為36.49%;40份材料擴增出B類型片段,占總材料的38.83%,GI均值為35.24%;在78份材料中,29份材料擴增出A類型片段,占總材料的37.18%,GI均值為28.23%;47份材料擴增出B類型片段,占總材料的60.25%,GI均值為35.35%;2份材料在瓊脂糖凝膠中沒有檢測到PCR產物。2種片段類型間的平均GI值在2個自然群體中差異均沒有統計學意義,說明TaDFR-B不適用于白粒小麥品種(系)材料穗發芽抗性篩選的鑒定。

1.延安11;2.京雙10號;3.豐抗10號;4.北京5號;5.樂亭1831;

6.定縣72;7.邯6172;8.太原566;9.CA0349;10.白硬冬2號。

1.Yanan 11;2.Jingshuang 10;3.Fengkang 10;4.Beijing 5;5.Laoting 1831;6.Dingxian 72;7.Han 6172;8.Taiyuan 566;9.CA0349;10.Baiyingdong 2.

圖2標記TaDFR-B的擴增結果

Fig.2The results of PCR amplification

with the marker TaDFR-B

3討論與結論

小麥種皮顏色與穗發芽和種子休眠密切相關[20]。小麥的種皮顏色是通過類黃酮生物合成途徑合成,而Tamyb10轉錄因子能激活類黃酮生物合成途徑[12]。本研究選用的STS標記Tamyb10D可有效地用于穗發芽抗性的材料篩選。該標記在103份小麥材料中擴增出2種片段類型,方差分析表明,這2簇數據的GI均值差異有統計學意義(P<0.001)。該標記在78份材料中也能擴增出2種片段類型,且2簇數據的平均GI值差異也有統計學意義(P=0.05)。

紅粒小麥的種皮顏色由類黃酮生物合成途徑產生的兒茶酸、原花青素和花青素組成[21]。TaDFR基因參與花青素的合成,CAPS標記TaDFR-B可有效地篩選出具有穗發芽抗性的紅粒小麥[14]。該分子標記在本研究中可擴增出2種類型的片段,證明在不同穗發芽抗性白粒小麥品種中TaDFR-B在啟動子區也存在8 bp插入的多態性,但在本研究中,該標記與白粒小麥的穗發芽抗性并不相關,可能是該基因在白粒小麥的種皮中表達不明顯或者不表達。

分子標記Vp1B3可以有效地篩選白粒小麥的穗發芽抗性[22],Vp1B3在白粒小麥中所鑒定出的3種等位基因類型TaVp1-Ba、TaVp1-Bb和TaVp1-Bc,其穗發芽抗性的大小為:TaVp1-Bb>TaVp1-Bc>TaVp1-Ba[1]。本研究綜合整理了前人對分子標記Vp1B3的研究,目的是結合分子標記Tamyb10D綜合篩選穗發芽抗性材料,提高結果的準確性和可靠性。整理結果如下:在103份材料中,屬于不同等位基因類型平均GI值的方差分析表明屬于TaVp1-Bb的品種與屬于TaVp1-Ba和TaVp1-Bc的品種平均GI值差異有統計學意義[17]。在78份材料中,屬于不同等位基因類型平均GI值的方差分析表明擴增出TaVp1-Ba的品種與擴增出TaVp1-Bb和TaVp1-Bc的品種GI均值差異有統計學意義[9]。

經過綜合分析后發現,分子標記Tamyb10D和Vp1B3的有效性和實用性較高,可以用于白粒小麥大規模的抗穗發芽基因型篩選。但在標記TaDFR-B與白粒小麥穗發芽抗性無關。其結果說明小麥籽粒休眠和穗發芽抗性遺傳基礎較為復雜,所以前人開發的有些分子標記缺乏通用性。

本研究中,標記TaDFR-B與穗發芽抗性差異沒有統計學意義,說明其不適用于白粒小麥品種(系)材料穗發芽抗性篩選。標記Tamyb10D與小麥穗發芽抗性相關,可以對不同白粒小麥品種(系)的穗發芽抗性進行有效篩選。通過分子標記Tamyb10D和Vp1B3結合發芽指數的綜合篩選,在103份材料中篩選出5份具有穗發芽抗性基因型材料(GI<10%),分別是:閬中白麥子、萬縣白麥子、陪陵須須白麥、川362和小白玉花,其單倍型分別是:Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bc;在78份材料中篩選出10份具有穗發芽抗性基因型材料(GI<10%),分別為西農6028、克群、百農3217、開封124、鄭州742、西昌5762、小偃5號、克壯、許躍6號和武農99,其單倍型均為Tamyb10D/Vp-1Bc。這15份材料可作為白粒小麥穗發芽抗性育種的抗性資源。

參考文獻：

[1]楊燕.小麥Vp-1基因的表達特性和STS標記的開發與應用[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2007.

[2]Derera N F,Bhatt G M,Mcmaster G J,et al.On the problem of preharvest sprouting of wheat[J].Euphytica,1977(26):299-308.

[3]劉光輝,楊隨莊,黃可冰,等.四川小麥穗發芽抗性鑒定及5個分子標記的有效性檢驗[J].麥類作物學報,2015(2):167-174.

[4]Ma L,Li Z,Ren T H,et al.Evaluation and validation of molecular marker association with preharvest sprouting tolerance in a RIL population[J].Journal of Triticeae Crops,2014,34(4):435-442.

[5]Kulwal P L,Kumar N,Gaur A,et al.Mapping of a major QTL for pre-harvest sprouting tolerance on chromosome 3A in bread wheat[J].Theoretical and Applied Genetics,2005,111(6):1052-1059.

[6]Singh R.Identification and validation of genomic regions associated with pre-harvest sprouting resistance in white-grained wheat [D].Saskatoon:Dissertation of Saskatchewan University,2008.

[7]Yang Y,Zhao X L,Xia L Q,et al.Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting resistance in Chinese wheats[J].Theoretical and Applied Genetics,2007,115:971-980.

[8]Xia L Q,Gana M W,Yang Y,et al.Exploiting the diversity of Viviparous-1 gene associated with pre-harvest sprouting tolerance in European wheat varieties[J].Euphytica,2008,159(3):411-417.

[9]Yang Y,He Z H,Xia L Q,et al.Distribution of Vp-1 alleles in Chinese white-grained landraces,historical,and current wheat cultivars[J].Creal Research Communication,2009,37:169-177.

[10]Mares D,Mrva K,Cheong J,et al.A QTL located on chromosome 4A associated with dormancy in white-and red-grained wheats of diverse origin[J].Theoretical and Applied Genetics,2005,111(7):1357-1364.

[11]Himi E,Nisar A.Colour genes(Rand Rc)for grain and coleoptile upregulate flavonoid biosynthesis genes in wheat[J].Genome,2005,48(4):747-754.

[12]Himi E,Maekawa M.Development of PCR markers for Tamyb10 related to R-1,red grain color gene in wheat[J].The Oritical and Applied Genetics,2011,122:1561-1576.

[13]王曉麗.Tamyb10基因在不同穗發芽抗性白粒小麥中等位變異的鑒定和分子標記研發[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2014.

[14]Bi H H,Sun Y W,Xiao Y G,et al.Characterization of DFR allelic variations and their associations with pre-harvest sprouting resistance in a set of red-grained Chinese wheat germplasm[J].Euphytica,2014,195(2):197-207.

[15]Mohan M,Nair S,Bhagwat A,et al.Genome mapping molecular markers and marker assisted selection in crop plant[J].Molecular Breeding,1997(3):87-103.

[16]肖世和,閆長生,張海平,等.小麥穗發芽研究[M].北京:中國農業技術出版社,2004.

[17]Yang Y,Zhang C L,Liu S X,et al.Characterization of the rich haplotypes of Viviparous-1A in Chinese wheats and development of a novel sequence-tagged site marker for pre-harvest sprouting resistance[J].Mol Breeding,2014,33:75-88.

[18]Lagudah E S,Appcls R,McNcil D.The Nor-D3 locus ofTriticumaestivum:natural variation and genetic linkage to markers in chromosome 5[J].Genome,1991,34:387-395.

[19]張兆萍,周麗敏,宋曉朋,等.小麥穗發芽抗性鑒定及相關分子標記的有效性驗證[J].麥類作物學報,2015(3):300-305.

[20]陳杰,陳鋒,詹克慧,等.普通小麥籽粒Tamyb10基因等位變異的分子檢測[J].麥類作物學報,2013,33(2):224-229.

[21]王根平,畢惠惠,孫永偉,等.紅粒小麥Tamybl0單倍型檢測及其與穗發芽抗性的關系[J].作物學報,2014,40(6):984-993.

[22]任立世,劉進英,楊燕,等.107份小麥歷史品種抗穗發芽基因型的檢測[J].麥類作物學報,2015,35(6):752-758.

Validation of Tamyb10D and TaDFR-B Associated with Pre-harvest Sprouting Tolerance and Screening the Genotypes with Higher PHS Tolerance in Chinese Wheats

WANG Yu,WANG Xiaoli,SUN Xiaoyan,LIU Jinying,YANG Yan

(College of Life Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot010010,China)

Abstract：The aim of this study was to assess the efficiency of two markers (Tamyb10D and TaDFR-B) associated with PHS tolerance and identify the genotypes with higher PHS tolerance in two sets of white-grained germplasm(103 cultivars and 78 cultivars existing in two sets of germplasm).The results indicated that the STS marker Tamyb10D was effective to selecting PHS resistance varieties,but TaDFR-B was not associated with PHS resistance in white-grained wheat.Combination with the result of Tamyb10D,germination index and previous reported result of Vp1B3,in 103 materials,total five resistance genotypes were selected out,they were Langzhongbaimai,Wanxianbaimaizi,Peilingxuxubaimai,Chuan 362 and Xiaobaiyuhua which haploids were Tamyb10D/Vp-1Bb,Tamyb10D/Vp-1Bb,Tamyb10D/Vp-1Bb,Tamyb10D/Vp-1Bb and Tamyb10D/Vp-1Bc,respectively;in another set of germplasm (78 materials),total ten resistance genotypes were selected out,they were Xinong 6028,Kequn,Bainong 3217,Kaifeng 124,Zhengzhou 742,Xichang 5762,Xiaoyan 5,Kezhuang,Xuyue 6 and Wunong 99,which haploids were Tamyb10D/Vp-1Bc.

Key words:Wheat;Pre-harvest sprouting;Tamyb10D;TaDFR-B

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.011

中圖分類號：Q37;S512.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0063-08

通訊作者：楊燕(1970-),女,內蒙古鄂爾多斯人,教授,博士,主要從事小麥品質生物學研究。

作者簡介：王瑜(1993-),女,內蒙古通遼人,在讀碩士,主要從事小麥品質生物學研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(31160247；31260320);內蒙古農業大學優秀青年科學基金項目(2014XYQ-18) ;內蒙古農業大學博士科研啟動基金項目(BJ07-62)

收稿日期：2015-10-15