基于系統生物學和合成生物學的重要平臺化學品生物制造的研究進展

袁海波，李江華，劉龍，堵國成，陳堅

（江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

?

基于系統生物學和合成生物學的重要平臺化學品生物制造的研究進展

袁海波，李江華，劉龍，堵國成，陳堅

（江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

摘要：基于生物質資源的平臺化學品制造，是解決目前石化資源枯竭和環境問題的重要措施，對經濟社會的可持續發展具有重要意義。本文主要介紹了系統生物學和合成生物學在有機酸（琥珀酸、富馬酸、L-蘋果酸、葡萄糖二酸、丙酮酸、苯丙酮酸、α-酮戊二酸）以及其他平臺化學品（2,5-呋喃二甲酸）生物制造中的應用，并展望了生物制造在平臺化學品生產中的未來發展方向。

關鍵詞：系統生物學；合成生物學；生物催化；生物技術；平臺化合物；生物制造

2015-07-01收到初稿，2015-08-16收到修改稿。

聯系人：陳堅。第一作者：袁海波（1991—），男，博士研究生。

Received date: 2015-07-01.

引 言

近年來，隨著人們對環境問題的日益關注以及全球石化資源供給的日趨緊張，生物制造在環境保護、生物能源以及生物基材料的開發等領域正受到人們越來越多的關注[1-3]。生物基材料的開發是生物制造的一項重要內容，它是以可再生的生物質資源為原料，利用微生物細胞或酶的催化功能來生產多種高附加值平臺化合物，這些化合物可經進一步加工或者直接使用來生產多種高附加值化工產品[2, 4]。2004年，美國能源部在一份名為“源自生物基質的高附加值化學品”的報告中，提出了12種未來最有價值的平臺化合物，包括：琥珀酸、2,5-呋喃二甲酸、3-羥基丙酸、谷氨酸、天冬氨酸、葡萄糖二酸、衣康酸、3-羥基丁內酯、乙酰丙酸、甘油、山梨醇和木糖醇[5]，圖1所示為該12種重要平臺化合物的化學結構。

圖1 12種重要平臺化合物化學結構Fig.1 Structures of 12 top value added bio-based chemicals

圖2 系統生物學和合成生物學在工業生產菌株改造中的應用Fig.2 Application of systems biology and synthetic biology in strain improvement for industrial products

近年來，系統生物學和合成生物學的快速發展，為定向改造微生物細胞生產目標化合物提供了有力的分析手段和工具，圖2所示為系統生物學和合成生物學在工業生產菌株改造中的應用[6]。目前，系統生物學的發展已經可以使人們從基因組層面去研究細胞的代謝網絡，包括代謝途徑中的關鍵基因、細胞代謝的復雜調節機制以及外界環境的擾動對細胞整體代謝的影響，進而通過建立代謝模型，評價和預測可能的代謝工程操作，從而改善細胞的生理機能和生產性狀。合成生物學作為綜合了生物科學和工程學的嶄新的研究領域，通過理性設計創建生物零件、模塊和系統甚至新物種，實現對現有的天然生物系統進行改造和優化，或者設計新的生物途徑或網絡，實現人工生物系統的構建[7]。本文總結了系統生物學和合成生物學技術在生物基平臺化學品制造領域的最新應用進展，并展望了生物制造在平臺化學品生產中的未來發展方向。

1 系統生物學和合成生物學與有機酸的生物制造

有機酸（organic acids）作為一類重要的平臺化學品，廣泛應用于食品、醫藥及化工生產等領域。目前，有20多種有機酸可以采用發酵法進行生產，有機酸的發酵生產行業已經逐漸成為發酵工業的重要支柱。

1.1 琥珀酸

琥珀酸又名丁二酸（succinate），是三羧酸循環的中間代謝產物，廣泛存在于人體、動植物以及微生物中[8]。琥珀酸作為一種重要的C4平臺化合物，可以替代由石油衍生的化學品來合成己二酸、1,4-丁二醇、γ-丁內酯、四氫呋喃等大宗化學品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）等可降解生物材料[9]。

琥珀酸生產菌株種類繁多，目前研究最多的是Actinobacillus succinogenes、Anaerobiosprillum succiniciproducens、Mannheimia succiniciproducens、Corynebacterium glutamicum和重組大腸桿菌[10-12]。由于培養條件相對簡單、生長迅速、遺傳背景和代謝途徑清楚等優點，大腸桿菌被廣泛應用于琥珀酸的生產[9]。重組大腸桿菌可以通過有氧、厭氧和兩階段發酵來生產琥珀酸[13-15]。其中，兩階段發酵過程包括有氧條件下菌體的生長和厭氧條件下琥珀酸的積累。近年來，隨著琥珀酸生物制造工業的快速發展，人們在大腸桿菌的代謝途徑改造和發酵工藝等方面做了大量的研究。尤其是在大腸桿菌的琥珀酸代謝途徑方面，如強化琥珀酸合成途徑、抑制或阻斷琥珀酸競爭途徑或者構建琥珀酸有氧生產體系，提高琥珀酸生產強度[16]。

1.1.1 強化琥珀酸合成途徑 有氧條件下，對于野生型大腸桿菌，琥珀酸僅作為三羧酸循環的中間產物，不作積累；在厭氧條件下，可以進行混合酸發酵產生少量的琥珀酸（7.8%）[17-18]。在厭氧條件下，葡萄糖先經糖酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），然后在PEP羧化酶作用下轉化為草酰乙酸（OAA），進而在蘋果酸脫氫酶和富馬酸還原酶的作用下生成琥珀酸（代謝途徑見圖3）。Millard等[19]在大腸桿菌中過表達了內源性基因ppc和pck，結果表明過表達ppc可以明顯提高琥珀酸的產量，而過表達pck對發酵結果沒有顯著影響，但是在ppc缺陷菌株中，過表達pck可以提高琥珀酸的產量。Liu等[20]通過在敲除了ldhA、pflB和ppc基因的大腸桿菌K12中過表達pck，額外提供了菌體生長所需的ATP，顯著提高了生物量和琥珀酸產量。此外，Kwon等[21]進一步研究發現，只有在添加重碳酸鹽的條件下，過表達PEP羧激酶才能提高琥珀酸產量。Wang等[22]和Goldberg等[23]通過在大腸桿菌中過表達富馬酸還原酶，可以直接將富馬酸轉化為琥珀酸，且轉化率達到93%。

圖3 大腸桿菌中琥珀酸合成途徑Fig.3 Central metabolic pathways related to succincate formation in E. coli

目前，很多研究者通過在大腸桿菌中引入外源的關鍵酶基因，來提高琥珀酸產量及生產強度。Kim 等[24]通過引入產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes的pck基因，使琥珀酸產量較出發菌株提高了6.5倍，與過表達內源性pck基因相比，效果顯著。Lin等[25]通過引入Sorghum vulgare中的ppc基因以及Lactococcus lactis中的丙酮酸羧化酶基因pyc，琥珀酸的產量大大提高，且乳酸、乙酸含量很低。Sánchez等[15]在大腸桿菌E. coli SBS550MG中引入檸檬酸合成酶基因cs，琥珀酸產量有了明顯提高，琥珀酸對葡萄糖的得率為1.58 mol·mol-1。Vemuri等[26]在E. coli AFP111中引入了來自菜豆根瘤菌Rhizobium etli的pyc基因，該菌株在雙階段發酵中琥珀酸產量可以達到99.2 g·L-1，生產強度為1.3 g·L-1·h-1。Yang等[27]在E. coli ZJG13中過表達了調控乙醛酸支路的aceKBA基因，結果表明對琥珀酸的生產強度影響較小。隨后，Yang等利用計算機模擬對琥珀酸生產途徑中的3個羧化酶——丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶和PEP羧化酶對琥珀酸產率的影響進行了分析，結果顯示丙酮酸羧化酶對琥珀酸產率影響最大，這一結果在實驗中得到了驗證。采用補料分批發酵策略，琥珀酸的產量可以達到36.1 g·L-1，生產強度為2.75 mmol·(g DCW)-1·h-1，是目前已報道的有氧發酵中生產強度最大的菌株。

1.1.2 抑制或阻斷琥珀酸競爭途徑 要提高琥珀酸產量，就必須減少E. coli中混酸發酵的副產物，如甲酸、乙酸及少量乳酸等，使代謝流更多流向琥珀酸。Chatterjee等[28]通過抑制E. coli中的磷酸轉移系統（PTS），使E. coli的生長和琥珀酸的產量都有所提高。Lee等[29]通過在基因組范圍內比較琥珀酸高效生產菌株M. Succiniciproducens和混合酸發酵下的E. coli中琥珀酸的中心代謝途徑，通過找出差異基因并對這些基因進行改造以提高E. coli發酵生產琥珀酸的產量。Lee等首先選擇了E. coli中的ptsG，pykF，sdhA，mqo和aceBA 5個基因，并對它們進行了組合失活，發現該方法并不能提高琥珀酸的產量。隨后，采用計算機模擬分析預測，發現敲除E. coli中與丙酮酸生成相關的3個酶——ptsG，pykF和pykA可以提高琥珀酸產量，這一結果在實驗中得到了驗證。Lin等[13,30]通過構建包含TCA循環氧化支路和乙醛酸循環的代謝工程菌株，有氧條件下，補料分批發酵，琥珀酸產量可以達到58.3 g·L-1，得率為0.85 mol·mol-1。Jantama等[14]以E. coli C菌株為基礎，通過敲除一系列與副產物生成相關的基因，構建了菌株E. coli KJ073（ΔldhA ΔadhEΔackAΔfocAΔpflBΔmgsAΔpoxB），在礦物鹽培養基中通過簡單控制pH分批發酵，琥珀酸產量可以達到688 mmol·L-1，琥珀酸對葡萄糖產率為1.2 mol·mol-1，生產強度為0.82 g·L-1·h-1。

目前，利用E. coli生產琥珀酸的突出問題是生產強度相對于某些瘤胃細菌還較低[31]。比如M. succiniciproducens的琥珀酸生產強度可以達到25.28 mmol·(g DCW)-1·h-1[32]。隨著系統和合成生物學的發展，人們對E. coli的生理代謝和調控機制方面的認識也會越來越清晰，進而可以通過定向改造和優化琥珀酸表達調控網絡或者重構有潛力的代謝途徑來提高琥珀酸生產強度。

1.2 富馬酸

富馬酸又名延胡索酸（fumaric acid），是一種重要的C4平臺化合物。富馬酸作為重要的精細化工產品和有機化工原料，廣泛應用于醫藥、材料、化工、飼料及食品添加劑等領域[33]。同時，富馬酸還可以通過酶催化、水合、氨化、加氫等工藝生產L-天冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸和1,4-丁二醇等C4化合物[5]。目前，工業上主要采用化學合成法和生物轉化法生產富馬酸。其中，化學合成法主要包括糠醛氧化法和順酐異構法。由于化學合成法面臨著化石資源的短缺和環境污染等問題，生物轉化法成為富馬酸產業發展和提升的有力技術支撐。

富馬酸的生物合成法包括微生物發酵和酶催化轉化法。酶催化轉化一般是用馬來酸異構酶催化馬來酸生成富馬酸。微生物發酵法主要是利用根霉菌、釀酒酵母和工程大腸桿菌發酵生產富馬酸[33-35]。

真菌是包括富馬酸在內的有機酸生產的主要菌株，其中根霉菌Rhizopus species的富馬酸產生能力較強，由于其環境適應能力強、易培養以及生長迅速等優點，使其成為了主要研究對象，主要包括少根根霉Rhizopus arrhizus和米根霉Rhizopus oryzae等。Osmani等[36]提出的關于富馬酸在根霉菌中積累的“胞液途徑”學說，是目前被認同的主流觀點。他們認為在少根根霉Rhizopus arrhizus的胞液中存在著TCA還原途徑，丙酮酸羧化酶是該途徑中的關鍵酶之一，它催化丙酮酸固定CO2生成草酰乙酸，然后草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和富馬酸酶的作用下生成富馬酸。Kenealy等[37]證實了該途徑是R. arrhizus中富馬酸生成的主要途徑，而TCA循環的作用主要是為菌體生長提供ATP和中間代謝物。Wright等[38]通過14C同位素標記得到了葡萄糖的代謝模型，證明了R. oryzae中存在兩個獨立的丙酮酸代謝池，一個位于胞液中用于合成富馬酸、乳酸及乙醇等，另外一個位于線粒體用于TCA循環。由于富馬酸酶在胞液途徑富馬酸的生成中的重要作用，Zhang等[39]在米根霉中表達了富馬酸酶基因fumR，結果顯示單純過表達富馬酸酶并不能提高富馬酸產量，因為富馬酸酶也可以催化富馬酸生成蘋果酸，因而L-蘋果酸產量反而有所提高。

近年來，研究者們也嘗試采用基因工程手段在釀酒酵母和大腸桿菌中重構富馬酸的代謝途徑。Kaclíková等[40]通過對釀酒酵母中的線粒體富馬酸酶進行突變失活，以葡萄糖為底物，富馬酸的產量約為0.5 g·L-1。吳世根等通過在畢赤酵母GS115中過表達丙酮酸羧化酶胞質同工酶，結果表明該酶的表達有助于草酰乙酸和L-蘋果酸的積累，富馬酸的產量僅有少量增加。Xu等[34]通過在釀酒酵母中表達來自米根霉的蘋果酸脫氫酶基因、富馬酸酶基因以及釀酒酵母自身的丙酮酸羧化酶基因，實現了富馬酸的積累，但是產量僅有3.18 g·L-1。Song等[35]通過敲除大腸桿菌中的異檸檬酸裂解酶調節因子基因iclR、富馬酸酶基因fumABC、葡萄糖特異性轉運蛋白ⅡCBGlc基因ptsG和天冬氨酸酶基因aspA，并且過表達了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，補料分批發酵63 h后，富馬酸的產量和生產強度分別達到了28.2 g·L-1和0.448 g·L-1·h-1。

1.3 L-蘋果酸

L-蘋果酸（L-malic acid）是生物體中三羧酸循環及其支路乙醛酸循環的中間代謝產物。作為一種重要的C4化合物，L-蘋果酸被廣泛應用于食品、醫藥和化工領域[41]。

L-蘋果酸的生物合成法主要有3種：第1種是直接發酵法，使用霉菌（米曲霉、黃曲霉及寄生曲霉等）以糖類為原料直接發酵生產L-蘋果酸；第2種是混合發酵，首先利用根霉菌將糖類轉化為富馬酸，然后再利用酵母將富馬酸轉化成L-蘋果酸；第3種是酶催化轉化，利用微生物的富馬酸酶直接將富馬酸轉化為L-蘋果酸。已有研究表明，曲霉等微生物生成L-蘋果酸的主要途徑是丙酮酸羧化支路途徑，即丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下固定CO2生成草酰乙酸，然后在蘋果酸脫氫酶作用下生成L-蘋果酸[42-43]。

目前，采用系統生物學及合成生物學手段來改造和構建L-蘋果酸生產菌株已成為蘋果酸高產菌株育種的主要研究方向。Zhang等[44]在生產琥珀酸的大腸桿菌（KJ060和KJ073）的基礎上敲除了富馬酸還原酶基因frdBC、蘋果酸酶基因sfcA和maeB以及富馬酸同功酶基因fumB和fumAC，構建了工程菌XZ658（KJ073?frdBC?sfcA?maeB?fumB?fumAC）。該菌株在雙階段發酵下，72 h后L-蘋果酸產量可以達到253 mmol·L-1，糖酸轉化率為1.42 mol·mol-1，生產強度為0.47 g·L-1·h-1。Mu等[45]首次采用合成生物學手段將大腸桿菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和釀酒酵母中蘋果酸脫氫酶引入到枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，成功構建了一條L-蘋果酸的異源生物合成途徑。該工程菌在進一步敲除乳酸脫氫酶基因后，采用兩階段發酵可以實現L-蘋果酸的積累，最大產量為(15.65±0.13)mmol·L-1。Zelle等[46]在丙酮酸脫羧酶缺陷型的釀酒酵母中過表達蘋果酸脫氫酶MDH3的等位基因、內源性丙酮酸羧化酶基因和蘋果酸轉運蛋白基因SpMAE1，分批培養下，L-蘋果酸產量達到59 g·L-1，糖酸轉化率為0.42 mol·mol-1。Oba等[47]從清酒醪中分離到一株高產蘋果酸的釀酒酵母，通過基因芯片技術比較該菌株和原始菌株的基因表達水平時發現，L-蘋果酸高產菌株中的應激反應基因如HSP12出現上調，而硫胺素合成基因THI4和SNZ2出現下調，此研究為今后代謝改造釀酒酵母生產L-蘋果酸提供了研究方向。

1.4 葡萄糖二酸

葡萄糖二酸（D-glucaric acid, GA）是一種天然存在于櫻桃、柑橘等水果和十字花科蔬菜中的無毒化合物，也少量存在于包括人類的哺乳類動物中[48-50]。葡萄糖二酸在糖尿病、癌癥的治療和降低膽固醇方面也有廣泛應用[49, 51-52]。葡萄糖二酸及其酯還可作為合成羥基化的尼龍和超支化聚酯的起始單體原料，具有巨大的應用潛力[5]。

目前，化學氧化法是制備葡萄糖二酸的主要方法，通過氧化D-葡萄糖來生產D-葡萄糖二酸，如硝酸氧化和以2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物（TEMPO）為介導的氧化[53-55]。微生物發酵法作為一種更為經濟、環保的方法越來越受到研究者的青睞。

葡萄糖二酸作為哺乳動物體內的代謝終產物，以葡萄糖為底物需要經過10步以上的反應才可以得到[49]。Marsh[56]用小鼠腺體中提取純化的葡萄糖醛酸酶，以葡萄糖醛酸為底物，在Fe2+和H2O2存在的條件下，可以得到葡萄糖二酸。目前，并沒有微生物存在從葡萄糖到葡萄糖二酸的完整的天然合成途徑的報道。

Moon等[57]首次用合成生物學的方法在E. coli中構建了一條葡萄糖二酸的合成途徑，成功實現了由葡萄糖到葡萄糖二酸的生物制備。研究者通過在E. coli中共表達了3個外源基因——釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，小鼠的肌醇氧化酶基因MIOX以及丁香假單胞菌Pseudomonas syringae中的糖醛酸脫氫酶基因Udh，構建了一條葡萄糖二酸的生物合成途徑。進一步研究發現，該途徑中催化肌醇轉化為葡萄糖醛酸的MIOX是限速酶，其活性受到底物肌醇濃度的直接影響。為了增大肌醇的有效濃度，從而提高葡萄糖二酸的產量，Moon等[58]依據蛋白之間的相互作用構建了多肽支架，將途徑中的3種酶組成蛋白復合體，提高了物質流的利用效率，使葡萄糖二酸的產量提高了5倍，達到2.5 g·L-1。隨后，Shiue 等[59]通過在MIOX的N端融合表達了SUMO（小泛素相關修飾物）標簽以及提高肌醇的轉運速率，以肌醇為底物，使葡萄糖二酸的產量提高至4.85 g·L-1。Shiue等在研究中發現，以肌醇為底物生產葡萄糖二酸時，存在產物抑制現象，葡萄糖二酸的產量無法超過5 g·L-1，這種現象可能是由于產物葡萄糖二酸的積累導致體系pH過低，從而引起細胞正常的生理和代謝機能發生變化[59-60]。Konishi 等[61]通過使用不同來源的Ino1、MIOX和Udh在大腸桿菌中構建了葡萄糖二酸的合成途徑，添加并且強化了Ino1，通過控制培養基中葡萄糖的濃度和采取補料分批發酵策略，葡萄糖二酸的產量可以達到73 g·L-1。

1.5 丙酮酸

丙酮酸（pyruvate）是生物體中重要的中間代謝產物，被廣泛應用于制藥、化工、農用化學品和保健品等行業。目前，丙酮酸的化學合成法主要有酒石酸法、乳酸催化氧化法、羥基丙酮法和電化學法等；生物合成法主要包括生物催化轉化法和直接發酵法。

早在20世紀50年代，就有學者對發酵法生產丙酮酸開始了研究。1989年，日本學者Miyata和Yonehara選育出了多種丙酮酸產量可以超過50 g·L-1的球擬酵母（Torulopsis）。其中，光滑球擬酵母Torulopsis glabrata是工業化生產上也是目前研究較多的菌株。丙酮酸作為糖酵解的最終產物，處于生物體內代謝的關鍵節點，很容易代謝生成其他產物，不易積累。要實現丙酮酸的大量積累，就需要弱化或切斷丙酮酸的進一步代謝。日本學者Yonehara和Yokota分別對多重維生素營養缺陷型球擬酵母和能量代謝有缺陷的大腸桿菌進行了研究，獲得了一株丙酮酸生產能力良好的多重維生素營養缺陷型T. glabrata IFO0005，正常培養條件下，丙酮酸對葡萄糖的產率為0.41 g·g-1。對該菌株通過誘變處理后，增加了一系列遺傳標記（如L-精氨酸營養缺陷型、L-異亮氨酸和L-纈氨酸營養缺陷型等），其丙酮酸產率可以達到0.54 g·g-1。李寅等[62]考察了T. glabrata WSH-IP303菌株在葡萄糖為碳源、氯化銨為唯一氮源的培養基中，不同維生素對丙酮酸產量的影響，分批發酵57.5 h后，丙酮酸的產量和產率分別達到了69.4 g·L-1和0.593 g·g-1。丙酮酸在多重維生素營養缺陷型菌株T. glabrata中的積累，被認為是由于以硫胺素為輔因子的丙酮酸脫氫酶系PDH受損，導致丙酮酸氧化脫羧減少造成的。

除了篩選營養缺陷型菌株用于丙酮酸的生產外，借助生化工程方法和代謝工程策略，綜合運用定量PCR（qPCR）、表達譜芯片、代謝物分析和關鍵酶活性分析等系統生物學手段來研究胞內NADH和ATP的代謝控制方式，也是提高T. glabrata丙酮酸生產效率的有效手段。Hua等通過代謝分析研究了不同溶氧濃度對丙酮酸發酵的影響，發現不同溶氧水平對能量代謝和關鍵代謝途徑的影響是不同的。當溶氧為30%～40%時，丙酮酸的產率提高了15%，且副產物乙醇的生成量減少。Li等[63]通過考察分批發酵中不同的體積溶氧系數對丙酮酸發酵的影響，結果表明分階段控氧比恒定KLa的丙酮酸生產強度有大幅度提高。通過代謝分析可知，抑制氧化磷酸化途徑中ATP的生成是提高丙酮酸生產強度的有效措施。劉立明等[64-65]通過選育T. glabrata的呼吸缺陷型突變株，削弱了氧化磷酸化的活性，提高了糖酵解速度，丙酮酸的生產強度也得到提高。由于細胞內NADH/NAD+的水平也會直接影響ATP的水平，劉立明等通過加入電子傳遞鏈抑制劑（抗霉素A和魚藤酮）和FoF1-ATPase抑制劑（寡霉素）或選育新霉素抗性菌株，達到了提高丙酮酸產量的目的。此外，Liu等[66]用高滲透條件篩選到一株可以耐受70 g·L-1NaCl的菌株T. glabrata RS23。此菌株以葡萄糖為碳源，丙酮酸產量和產率可以達到94.3 g·L-1和0.635 g·g-1。Wang 等[67]通過DNA重組技術敲除了T. glabrata中的丙酮酸脫羧酶PDC，減少了發酵過程中副產物乙醇的產生，丙酮酸產量可以達到82.2 g·L-1。Zeli?等[68]構建了一株重組大腸桿菌E. coli YYC202 ldhA::Kan，該菌株喪失了丙酮酸轉化為乙酰輔酶A、醋酸和乳酸的能力，利用該菌株發酵生產丙酮酸產率可以達到0.54 g·g-1。

1.6 α-苯丙酮酸

α-苯丙酮酸（phenylpyruvic acid, PPA）是一種雙羰基化合物，廣泛應用于醫藥、食品和化工生產等領域[69]。PPA是合成D-苯丙氨酸的前體，而D-苯丙氨酸可以用來生產手性藥物和食品添加劑[70]。此外，PPA還可以用來生產苯乳酸和阿斯巴甜等。

目前，PPA的生產主要是化學合成法和生物轉化法。化學法主要有海因法、雙羰基化法和α-乙酰氨基肉桂酸水解法等。相對于化學合成法，生物轉化法具有環境污染小、生產成本低以及產物安全性高等優點，正受到人們的廣泛關注。

PPA的生物轉化法主要包括微生物發酵法和酶轉化法。但是由于發酵法的PPA產量較低（1.05 g·L-1），因此目前研究較多的是酶轉化法[71]。酶轉化法是通過L/D-氨基酸脫氨酶（LAAO/DAAO）催化L/D-苯丙氨酸脫氨基生成。但是由于D-苯丙氨酸價格較高以及DAAO催化過程產生的雙氧水對轉化的不利影響，因此目前主要采用非雙氧水生成型的LAAO進行PPA的生產。LAAO廣泛存在于蛇毒、真菌、細菌、藻類及動物中。其中，來源于普通變形桿菌Proteus vulgaris、奇異變形桿菌Proteus mirabilis、雷特格氏變形桿菌Proteus rettgeri、魔氏變形桿菌Proteus morganii以及普羅維登斯菌屬Providence的菌株因具有苯丙氨酸脫氨酶而被廣泛研究[72]。

有研究者在E. coli BL21（DE3）中表達了來源于P. mirabilis KCTC2566的脫氨酶基因pma，在最優條件下，以濃度為14 g·L-1的L-苯丙氨酸為底物，PPA的產量可以達到6.2 g·L-1，轉化率為44.6%。隨后，利用易錯PCR對該脫氨酶進行定向進化并且敲除了E. coli中與L-苯丙氨酸進一步代謝有關的基因，最終PPA的產量和轉化率分別達到了11.5 g·L-1和82%[73]。

1.7 α-酮戊二酸

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）作為三羧酸循環（TCA 循環）中重要的中間代謝產物，參與體內氨基酸、糖類以及脂肪代謝等多種代謝過程。因此，α-酮戊二酸被廣泛應用于食品、醫療以及化工生產等領域[74]。目前，工業上生產α-酮戊二酸主要采用的是化學合成法，但是化學合成過程中使用的氰化物和重金屬離子等有毒試劑，限制了α-酮戊二酸在食品和醫療等領域的應用。因此，生物法成為了生產α-酮戊二酸的最佳選擇。

目前，人們已經發現了多種可以過量積累α-KG的微生物，包括多種原核微生物和真核微生物[75-77]。由于真核微生物相對于原核微生物來說，能耐受更低的pH條件，更適合發酵生產短鏈有機酸[78]，因此目前研究的生產α-KG的菌株多以真核微生物為主。其中，解脂亞洛酵母Yarrowia lipolytica因其生長迅速、生理特征清晰、底物譜寬和安全性等優點，越來越受到人們的重視[79]。

由于α-KG在三羧酸循環中處于關鍵位置，并且連接著碳-氮代謝，參與細胞內多種調控過程，因此采取基于代謝組學的系統生物學手段對微生物積累α-KG的過程進行系統分析，對于揭示微生物的代謝機理和實現α-KG的過量積累具有重要的意義。α-KG生產菌株在積累α-KG的過程中，存在兩個重要的代謝節點：一是丙酮酸在丙酮酸脫氫酶系PDHC作用下生成乙酰輔酶A，然后進入TCA循環；二是α-酮戊二酸脫氫酶系KGDH催化的α-KG的進一步代謝。硫胺素作為PDHC和KGDH的輔因子，是α-KG積累的關鍵因素。Chernyavskaya等[80]對硫胺素營養缺陷型菌株Y. lipolytica N1在不同硫胺素濃度、氮源、pH和溶氧下α-KG的產量進行了研究，結果顯示亞適量硫胺素和過量氮源是積累α-KG的必要條件，在最佳條件下α-KG的產量可以達到49.0 g·L-1，對乙醇產率為42%。緊接著，Il’chenko等[81]對Y. lipolytica N1菌株中心代謝途徑中關鍵酶的活性進行了研究，結果顯示在積累α-KG階段，KGDH和檸檬酸合酶活性較低，而依賴于NADPH的異檸檬酸脫氫酶具有較高活性。為了提高α-KG的產量，基于增大流向目標產物的代謝流和減弱目標產物的進一步代謝的代謝工程改造是較為有效的手段。為了增大流向目標產物的代謝流，Foerster等[82]在Y. lipolytica H222中過表達了異檸檬酸裂解酶ICL1，實現了菌體在總產酸不變的情況下，異檸檬酸占總酸比例的顯著下降。隨后，Holz等[83]通過表達順烏頭酸酶ACO1，使異檸檬酸占總酸的比例由35%～49%提高到66%～71%。Yin等[84]在Y. lipolytica WSH-Z06中分別過表達了來自釀酒酵母和米根霉的丙酮酸羧化酶PYC，重組菌株的α-KG產量分別提高了24.5%和35.3%，在3 L發酵罐上的產量可以達到69.2 g·L-1。此外，通過削弱α-KG的進一步代謝是提高α-KG產量的另一策略。Verseck等敲除了C. glutmicum菌株的谷氨酸脫氫酶基因gdh，使得α-KG在發酵液中的濃度達到5 g·L-1。Holz 等[85]在研究KGDH對Y. lipolytica的產酸影響時，利用生物信息學技術，將Y. lipolytica與S. cerevisiae 中KGDH的3個基因（ScKGD1，KGD2，LPD1）進行了比較分析，找到了Y. lipolytica中的3個相應基因YlKGD1，YlKGD2和YlLPD1，并將這3個基因在Y. lipolytica中進行過量表達。發酵結果顯示，α-KG的產量從原始菌中的97 g·L-1下降到重組菌中的72 g·L-1，而丙酮酸含量有所提高。

雖然在微生物代謝生產α-KG的機制及代謝工程改造方面已經取得一定成果，但是依然存在著過量積累α-KG機制不清楚以及代謝副產物過多等問題。

1.8 2,5-呋喃二甲酸

2,5-呋喃二甲酸（2,5-furandicarboxylic acid, FDCA）作為一種重要的化工原料及有機合成中間體，廣泛應用在醫藥、抗菌劑和高分子材料的合成中[86-87]。此外，由于2,5-呋喃二甲酸的結構和性質與對苯二甲酸相似，可以作為其替代品用于聚酯類材料的制造[88-90]。

2,5-呋喃二甲酸可以由5-羥甲基糠醛（HMF）氧化生成，而5-羥甲基糠醛可以由葡萄糖或果糖脫水而成。目前，對于FDCA的生產，主要是化學合成法。FDCA的化學合成需要高壓、高溫、有機溶劑和金屬離子催化，致使整個生產工藝高成本和高污染，不利于實際生產應用[91-93]。與化學催化不同的是，生物（酶或全細胞）催化可以在相對溫和的條件下進行，可以顯著降低生產成本和有害物質的排放[94]。然而，目前用生物催化法生產FDCA的研究還處于初始階段，已報到的文獻中只有極少的酶可以氧化HMF生成FDCA。其中來源于Caldariomyces fumago的氯過氧化物酶可以氧化HMF，生成74%的2,5-呋喃二甲醛和20%的5-羥甲基-2-呋喃甲酸，但是不能生成FDCA[95]。近年來，Koopman等[96]通過轉座子突變篩選鑒定出了貪銅菌Cupriavidus basilensis HMF14中的HMF和呋喃甲醛的代謝途徑，證實了5-羥甲基糠醛氧化還原酶（HmfH）可以將5-羥甲基糠醛氧化為2,5-呋喃二甲酸。隨后，Koopman等[97]在惡臭假單胞菌Pseudomonas putida S12中異源表達了HmfH，以甘油為碳源，補料分批培養，可以得到30.1 g·L-1的FDCA，產率為97%。該惡臭假單胞菌Pseudomonas putida S12自身只能催化HMF生成5-羥甲基-2-呋喃甲酸，只有表達了來源于貪銅菌Cupriavidus basilensis HMF14中的HmfH基因后，才可以催化HMF生成FDCA。隨后，Dijkman等[98-99]在大腸桿菌中表達了來源于甲基營養菌Methylovorus sp. strain MP688的5-羥甲基糠醛氧化酶（HMFO），該酶不僅可以將HMF氧化為FDCA，而且還可以氧化芳香族醇類和醛類物質，該酶可以在24 h內將95%的HMF轉化為FDCA。

雖然人們對5-羥甲基糠醛氧化酶研究還處于起始階段，但生物催化仍是未來2,5-呋喃二甲酸生產的重要研究方向。

2 展 望

系統生物學和合成生物學的飛速發展，為理性改造微生物提供了技術手段。系統生物學的發展使人們能夠從整體水平上來理解和把握微生物的生理、代謝和功能，有助于識別代謝途徑中的關鍵靶基因，從而對其進行代謝工程操作。另外，關于目標代謝途徑和表達宿主的系統生物學研究也為合成生物學的開展提供了重要的參考。

生物制造離不開生物細胞轉化技術，即利用微生物細胞或酶將底物轉化為目標產物的過程。微生物轉化技術在平臺化學品如葡糖糖二酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等有機酸的生產中已展現出良好的應用前景。盡管我國在有機酸制造工業取得了顯著成績，但是總體技術仍低于國際同期水平，特別是在轉化率、物耗和能耗以及產品質量等產業化指標方面仍明顯落后于國際先進水平。因此，通過系統改造微生物代謝過程，構建高效的生物合成途徑，是提高微生物轉化水平的重要途徑，也是推動生物制造業可持續發展的重要舉措。

References

[1] KERR R A. Global warming is changing the world [J]. Science, 2007, 316(5822): 188-190.

[2] LEE J W, NA D, PARK J M, et al. Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals [J]. Nature Chemical Biology, 2012, 8(6): 536-546.

[3] JANG Y S, PARK J M, CHOI S, et al. Engineering of microorganisms for the production of biofuels and perspectives based on systems metabolic engineering approaches [J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(5): 989-1000.

[4] STEEN E J, KANG Y, BOKINSKY G, et al. Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass [J]. Nature, 2010, 463(7280): 559-562.

[5] WERPY T, PETERSEN G. Top Value Added Chemicals from Biomass: Volume I -- Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas[M]. United States: USDOE, 2004.

[6] BARRETT C L, KIM T Y, KIM H U, et al. Systems biology as a foundation for genome-scale synthetic biology [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17(5): 488-492.

[7] 劉奪, 杜瑾, 趙廣榮, 等. 合成生物學在醫藥及能源領域的應用[J]. 化工學報, 2011, 62(9): 2391-2397. LIU D, DU J, ZHAO G R, et al. Applications of synthetic biology in medicine and energy [J]. CIESC Journal, 2011, 62(9): 2391-2397.

[8] 徐冰, 馬江鋒, 梁麗亞, 等. 基于高密度培養的反復分批發酵法生產丁二酸 [J]. 化工學報, 2011, 62(9): 2595-2599. XU B, MA J F, LIANG L Y, et al. Succinic acid production by repeated batch fermentation based on high density culture [J]. CIESC Journal, 2011, 62(9): 2595-2599.

[9] MCKINLAY J, VIEILLE C, ZEIKUS J G. Prospects for a bio-based succinate industry [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76(4): 727-740.

[10] LEE S J, SONG H, LEE S Y. Genome-based metabolic engineering of Mannheimia succiniciproducens for succinic acid production [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(3): 1939-1948.

[11] MEYNIAL-SALLES I, DOROTYN S, SOUCAILLE P. A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield, titer, and productivity [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2008, 99(1): 129-135.

[12] OKINO S, NOBURYU R, SUDA M, et al. An efficient succinic acid production process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008,81(3): 459-464.

[13] LIN H, BENNETT G N, SAN K Y. Fed-batch culture of a metabolically engineered Escherichia coli strain designed for high-level succinate production and yield under aerobic conditions [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2005, 90(6): 775-779.

[14] JANTAMA K, HAUPT M J, SVORONOS S A, et al. Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate and malate [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2008, 99(5): 1140-1153.

[15] SáNCHEZ A M, BENNETT G N, SAN K Y. Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity [J]. Metabolic Engineering, 2005, 7(3): 229-239.

[16] 王樂, 倪子富, 惠明, 等. 代謝控制發酵產琥珀酸研究進展 [J].化工學報, 2015, 66(4): 1243-1251. WANG L, NI Z F, HUI M, et al. Research advances in metabolic control of succinic acid fermentation [J]. CIESC Journal, 2015, 66(4): 1243-1251.

[17] CLARK D P. The fermentation pathways of Escherichia coli [J]. FEMS Microbiology Reviews, 1989, 5(3): 223-234.

[18] WENDISCH V F, BOTT M, EIKMANNS B J. Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids [J]. Current Opinion in Microbiology, 2006, 9(3): 268-274.

[19] MILLARD C S, CHAO Y P, LIAO J C, et al.. Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(5): 1808-1810.

[20] LIU R, LIANG L, CHEN K, et al. Fermentation of xylose to succinate by enhancement of ATP supply in metabolically engineered Escherichia coli [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(4): 959-968.

[21] KWON Y D, LEE S Y, KIM P. Influence of gluconeogenic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK) expression on succinic acid fermentation in Escherichia coli under high bicarbonate condition [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 16(9): 1448-1452.

[22] WANG X, GONG C S, TSAO G. Bioconversion of fumaric acid to succinic acid by recombinant E. coli [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1998, 70/71/72: 919-928.

[23] GOLDBERG I, LONBERG-HOLM K, BAGLEY E A, et al. Improved conversion of fumarate to succinate by Escherichia coli strains amplified for fumarate reductase [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1983, 45(6): 1838-1847.

[24] KIM P, LAIVENIEKS M, VIEILLE C, et al. Effect of overexpression of Actinobacillus succinogenes phosphoenolpyruvate carboxykinase on succinate roduction in Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(2): 1238-1241.

[25] LIN H, SAN K Y, BENNETT G. Effect of Sorghum vulgare phosphoenolpyruvate carboxylase and Lactococcus lactis pyruvate carboxylase coexpression on succinate production in mutant strains of Escherichia coli [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67(4): 515-523.

[26] VEMURI G N, EITEMAN M A, ALTMAN E. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4): 1715-1727.

[27] YANG J, WANG Z, ZHU N, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli and in silico comparing of carboxylation pathways for high succinate productivity under aerobic conditions [J]. Microbiological Research, 2014, 169(5/6): 432-440.

[28] CHATTERJEE R, MILLARD C S, CHAMPION K, et al. Mutation of the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 148-154.

[29] LEE S J, LEE D Y, KIM T Y, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 7880-7887.

[30] LIN H, BENNETT G, SAN K Y. Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli [J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, 32(3): 87-93.

[31] SONG H, LEE S Y. Production of succinic acid by bacterial fermentation [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 352-361.

[32] KIM T Y, KIM H U, PARK J M, et al. Genome-scale analysis of Mannheimia succiniciproducens metabolism [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4): 657-671.

[33] 高振, 張昆, 黃和, 等. 利用根霉菌生產富馬酸 [J]. 化學進展, 2009, 21(1): 251-258. GAO Z, ZHANG K, HUANG H, et al. Fumaric acid production by Rhizopus sp. [J]. Progress in Chemistry, 2009, 21(1): 251-258.

[34] XU G, ZOU W, CHEN X, et al. Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering [J]. PLoS ONE, 2012, 7(12): e52086.

[35] SONG C W, KIM D I, CHOI S, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of fumaric acid [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2013, 110(7): 2025-2034.

[36] OSMANI S A, SCRUTTON M C. The sub-cellular localisation and regulatory properties of pyruvate carboxylase from Rhizopus arrhizus [J]. European Journal of Biochemistry, 1985, 147(1): 119-128.

[37] KENEALY W, ZAADY E, DU PREEZ J C, et al. Biochemical aspects of fumaric acid accumulation by Rhizopus arrhizus [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52(1): 128-133.

[38] WRIGHT B E, LONGACRE A, REIMERS J. Models of metabolism in Rhizopus oryzae [J]. Journal of Theoretical Biology, 1996, 182(3): 453-457.

[39] ZHANG B, YANG S T. Metabolic engineering of Rhizopus oryzae: effects of overexpressing fumR gene on cell growth and fumaric acid biosynthesis from glucose [J]. Process Biochemistry, 2012, 47(12): 2159-2165.

[40] KACLíKOVá E, LACHOWICZ T M, GBELSKá Y, et al. Fumaric acid overproduction in yeast mutants deficient in fumarase [J]. FEMS Microbiology Letters, 1992, 91(2): 101-106.

[41] MOON S Y, HONG S H, KIM T Y, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of malic acid [J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 40(2): 312-320.

[42] BATTAT E, PELEG Y, BERCOVITZ A, et al. Optimization of L-malic acid production by Aspergillus flavus in a stirred fermentor [J]. Biotechnology and Bioengineering, 1991, 37(11): 1108-1116.

[43] 周小燕, 陳素云, 吳清平, 等. 通氣條件對曲霉N1-14'產生L-蘋果酸的影響 [J]. 食品與發酵工業, 2000, 26(1): 11-15. ZHOU X Y, CHEN S Y, WU Q P, et al. Effects of aeration conditions on L-malic acid production by Aspergillus sp. N1-14'[J]. Food and Fermentation Industries, 2000, 26(1): 11-15.

[44] ZHANG X, WANG X, SHANMUGAM K T, et al. L-Malate production by metabolically engineered Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(2): 427-434.

[45] MU L, WEN J. Engineered Bacillus subtilis 168 produces L-malate by heterologous biosynthesis pathway construction and lactate dehydrogenase deletion [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(1): 33-41.

[46] ZELLE R M, DE HULSTER E, VAN WINDEN W A, et al. Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae: engineering of pyruvate carboxylation, oxaloacetate reduction, and malate export [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(9): 2766-2777.

[47] OBA T, SUENAGA H, NAKAYAMA S, et al. Properties of a high malic acid-producing strains of Saccharomyces cerevisiae isolated from sake mash [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2011, 75(10): 2025-2029.

[48] MARSH C A. Metabolism of D-glucuronolactone in mammalian systems (2): Conversion of D-glucuronolactone into D-glucaric acid by tissue preparations [J]. Biochemical Journal, 1963, 87(1): 82-90.

[49] WALASZEK Z, SZEMRAJ J, HANAUSEK M, et al. D-Glucaric acid content of various fruits and vegetables and cholesterol-lowering effects of dietary D-glucarate in the rat [J]. Nutrition Research, 1996, 16(4): 673-681.

[50] OEN H, VESTRHEIM S R. Detection of non-volatile acids in sweet cherry fruits [J]. Acta Agriculturae Scandinavica, 1985, 35(2): 145-152.

[51] BHATTACHARYA S, MANNA P, GACHHUI R, et al. D-Saccharic acid 1,4-lactone protects diabetic rat kidney by ameliorating hyperglycemia-mediated oxidative stress and renal inflammatory cytokines via NF-κB and PKC signaling [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2013, 267(1): 16-29.

[52] GUPTA K P, SINGH J. Modulation of carcinogen metabolism and DNA interaction by calcium glucarate in mouse skin [J]. Toxicological Sciences, 2004, 79(1): 47-55.

[53] MERBOUH N, BOBBITT J M, BRüCKNER C. 4-AcNH-TEMPO-catalyzed oxidation of aldoses to aldaric acids using chlorine or bromine as terminal oxidants [J]. Journal of Carbohydrate Chemistry, 2002, 21(1/2): 65-77.

[54] PAMUK V, YILMAZ M, ALICILAR A. The preparation of D-glucaric acid by oxidation of molasses in packed beds [J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2001, 76(2): 186-190.

[55] MEHLTRETTER C L, RIST C E. Sugar oxidation, saccharic and oxalic acids by the nitric acid oxidation of dextrose [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1953, 1(12): 779-783.

[56] MARSH C A. Biosynthesis of D-glucaric acid in mammals: a free-radical mechanism? [J]. Carbohydrate Research, 1986, 153(1): 119-131.

[57] MOON T S, YOON S H, LANZA A M, et al. Production of glucaric acid from a synthetic pathway in recombinant Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(3): 589-595.

[58] MOON T S, DUEBER J E, SHIUE E, et al. Use of modular, synthetic scaffolds for improved production of glucaric acid in engineered E. coli [J]. Metabolic Engineering, 2010, 12(3): 298-305.

[59] SHIUE E, PRATHER K L J. Improving D-glucaric acid production from myo-inositol in E. coli by increasing MIOX stability and myo-inositol transport [J]. Metabolic Engineering, 2014, 22: 22-31.

[60] WARNECKE T, GILL R T. Organic acid toxicity, tolerance, and production in Escherichia coli biorefining applications [J]. Microbial Cell Factories, 2005, 4: 25.

[61] KONISHI K, IMAZU S. Method for producing glucaric acid: US20150010969A1[P]. 2015-01-08.

[62] 李寅, 陳堅, 倫世儀, 等. 維生素在丙酮酸過量合成中的重要作用[J]. 微生物學報, 2000, 40(5): 528-534. LI Y, CHEN J, LUN S Y, et al. The important role of vitamins in the over-production of pyruvic acid [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2000, 40(5): 528-534.

[63] LI Y, HUGENHOLTZ J, CHEN J, et al. Enhancement of pyruvate production by Torulopsis glabrata using a two-stage oxygen supply control strategy [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 60(1/2): 101-106.

[64] 劉立明, 陳堅, 李華鐘, 等. 氧化磷酸化抑制劑對光滑球擬酵母糖酵解速度的影響 [J].生物化學與生物物理進展, 2005, 32(3): 251-257. LIU L M, CHEN J, LI H Z, et al. Effect of oxidative phosphorylation inhibitors on the glycolytic flux in Torulopsis glabrata [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2005, 32(3): 251-257.

[65] LIU L M, LI Y, DU G C, et al. Increasing glycolytic flux in Torulopsis glabrata by redirecting ATP production from oxidative phosphorylation to substrate-level phosphorylation [J]. Journal of Applied Microbiology, 2006, 100(5): 1043-1053.

[66] LIU L, XU Q, LI Y, et al. Enhancement of pyruvate production by osmotic-tolerant mutant of Torulopsis glabrata [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4): 825-832.

[67] WANG Q, HE P, LU D, et al. Metabolic engineering of Torulopsis glabrata for improved pyruvate production [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36(5/6): 832-839.

[68] ZELI? B, VASI?-RA?KI ?, WANDREY C, et al. Modeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed-batch bioreactor [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2004, 26(4): 249-258.

[69] 肖慧萍, 邱祖民, 鄭典模, 等. 苯丙酮酸的合成進展 [J].內蒙古工業大學學報(自然科學版), 2002, 21(1): 9-15. XIAO H P, QIU Z M, ZHENG D M, et al. The synthetic development of phenylpyruvic acid [J]. Journal of Inner Mongolia Polytechnic University(Natural Science Edition), 2002, 21(1): 9-15.

[70] PANTALEONE D P, GELLER A M, TAYLOR P P. Purification and characterization of an L-amino acid deaminase used to prepare unnatural amino acids [J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11(4/5/6): 795-803.

[71] COBAN H, DEMIRCI A, PATTERSON P, et al. Screening of phenylpyruvic acid producers and optimization of culture conditions in bench scale bioreactors [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2014, 37(11): 2343-2352.

[72] SMIT J A. Specific activity of phenylalanine deaminase in extracts of the proteus-providence group [J]. Nature, 1966, 211(5052): 1003.

[73] 陳堅, 周景文, 劉龍. 新型有機酸的生物法制造技術[M]. 北京:化學工業出版社, 2015: 265-274. CHEN J, ZHOU J W, LIU L. Synthesis of Organic Acids by Biological Methods [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2015:265-274.

[74] MATZI V, LINDENMANN J, MUENCH A, et al. The impact of preoperative micronutrient supplementation in lung surgery. A prospective randomized trial of oral supplementation of combined α-ketoglutaric acid and 5-hydroxymethylfurfural [J]. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery, 2007, 32(5): 776-782.

[75] LOCKWOOD L B, STODOLA F H. Preliminary studies on the production of alpha-ketoglutaric acid by Pseudomonas fluorescens [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1946, 164: 81-83.

[76] TANAKA K, KIMURA K, YAMAGUCHI K. Process for producing L-glutamic acid and alpha-ketoglutaric acid: US 3450599A[P]. 1969-06-17.

[77] FINOGENOVA T V, LOZINOV A B, BELIKOV V M, et al. Keto-acid production by paraffin-oxidizing yeasts [J]. Mikrobiologiia, 1968, 37(1): 38-43.

[78] YUZBASHEV T V, YUZBASHEVA E Y, SOBOLEVSKAYA T I, et al. Production of succinic acid at low pH by a recombinant strain of the aerobic yeast Yarrowia lipolytica [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 107(4): 673-682.

[79] BEOPOULOS A, CESCUT J, HADDOUCHE R, et al. Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production [J]. Progress in Lipid Research, 2009, 48(6): 375-387.

[80] IL’CHENKO A P, CHERNYAVSKAYA O G, SHISHKANOVA N V, et al. Metabolic characteristics of the mutant Yarrowia lipolytica strain 1 producing alpha-ketoglutaric and citric acids from ethanol and the effect of NH+4and O2on yeast respiration and acidogenesis [J]. Microbiology, 2001, 70(2): 151-157.

[81] IL’CHENKO A P, CHERNYAVSKAYA O G, SHISHKANOVA N V, et al. Metabolism of Yarrowia lipolytica grown on ethanol under conditions promoting the production of alpha-ketoglutaric and citric acids: a comparative study of the central metabolism enzymes [J]. Microbiology, 2002, 71(3): 269-274.

[82] FOERSTER A, JACOBS K, JURETZEK T, et al. Overexpression of the ICL1 gene changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 77(4): 861-869.

[83] HOLZ M, FOERSTER A, MAUERSBERGER S, et al. Aconitase overexpression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 81(6): 1087-1096.

[84] YIN X, MADZAK C, DU G, et al. Enhanced alpha-ketoglutaric acid production in Yarrowia lipolytica WSH-Z06 by regulation of the pyruvate carboxylation pathway [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(6): 1527-1537.

[85] HOLZ M, OTTO C, KRETZSCHMAR A, et al. Overexpression of alpha-ketoglutarate dehydrogenase in Yarrowia lipolytica and its effect on production of organic acids [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 89(5): 1519-1526.

[86] ROMáN-LESHKOV Y, CHHEDA J N, DUMESIC J A. Phase modifiers promote efficient production of hydroxymethylfurfural from fructose [J]. Science, 2006, 312(5782): 1933-1937.

[87] LEWKOWSKI J. Synthesis, chemistry and applications of 5-hydroxymethylfurfural and its derivatives [J]. Arkivoc, 2001: 17-54.

[88] CHRISTENSEN C H, RASS-HANSEN J, MARSDEN C C, et al. The renewable chemicals industry [J]. ChemSusChem, 2008, 1(4): 283-289.

[89] ZHU J, CAI J, XIE W, et al. Poly(butylene 2,5-furan dicarboxylate), a biobased alternative to PBT: synthesis, physical properties, and crystal structure [J]. Macromolecules, 2013, 46(3): 796-804.

[90] KAMM B. Production of platform chemicals and synthesis gas from biomass [J]. Angewandte Chemie:International Edition, 2007, 46(27): 5056-5058.

[91] CASANOVA O, IBORRA S, CORMA A. Biomass into chemicals: aerobic oxidation of 5-hydroxymethyl-2-furfural into 2,5-furandicarboxylic acid with gold nanoparticle catalysts [J]. ChemSusChem, 2009, 2(12): 1138-1144.

[92] CARLINI C, PATRONO P, GALLETTI A M R, et al. Selective oxidation of 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde to furan-2,5-dicarboxaldehyde by catalytic systems based on vanadyl phosphate [J]. Applied Catalysis A: General, 2005, 289(2): 197-204.

[93] GORBANEV Y Y, KLITGAARD S K, WOODLEY J M, et al. Gold-catalyzed aerobic oxidation of 5-hydroxymethylfurfural in water at ambient temperature [J]. ChemSusChem, 2009, 2(7): 672-675.

[94] THOMAS S M, DICOSIMO R, NAGARAJAN V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry [J]. Trends in Biotechnology, 2002, 20(6): 238-242.

[95] VAN DEURZEN M P J, VAN RANTWIJK F, SHELDON R A. Chloroperoxidase-catalyzed oxidation of 5-hydroxymethylfurfural [J]. Journal of Carbohydrate Chemistry, 1997, 16(3): 299-309.

[96] KOOPMAN F, WIERCKX N, DE WINDE J H, et al. Identification and characterization of the furfural and 5-(hydroxymethyl)furfural degradation pathways of Cupriavidus basilensis HMF14 [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(11): 4919-4924.

[97] KOOPMAN F, WIERCKX N, DE WINDE J H, et al. Efficient whole-cell biotransformation of 5-(hydroxymethyl)furfural into FDCA, 2,5-furandicarboxylic acid [J]. Bioresource Technology, 2010, 101(16): 6291-6296.

[98] DIJKMAN W P, FRAAIJE M W. Discovery and characterization of a 5-hydroxymethylfurfural oxidase from Methylovorus sp. strain MP688 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(3): 1082-1090.

[99] DIJKMAN W P, GROOTHUIS D E, FRAAIJE M W. Enzyme-catalyzed oxidation of 5-hydroxymethylfurfural to furan-2,5-dicarboxylic acid [J]. Angewandte Chemie-International Edition, 2014, 53(25): 6515-6518.

Foundation item: supported by the National Basic Research Program of China (2012CB720802, 2013CB733602) and the National Natural Science Foundation of China (21390204).

Advances in production of important platform chemicals by bio-manufacturing based on systems biology and synthetic biology

YUAN Haibo, LI Jianghua, LIU Long, DU Guocheng, CHEN Jian
(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Abstract:Due to the limited amount of fossil fuels and global warming problem, bio-manufacturing based on renewable biomass has been paid more attention. In this review, the contribution of systems biology and synthetic biology in bio-manufacture of platform chemicals like organic acid such as succinate, fumarate, malate, glucaric acid, pyruvate, phenylpyruvic acid, α-ketoglutarate and other platform chemicals such as 2,5-furandicarboxylic acid are reviewed. Finally, the trends of bio-manufacture for platform chemical are prospected.

Key words：systems biology；synthetic biology；biocatalysis；biotechnology；platform chemical；bio-manufacture

Corresponding author:Prof. CHEN Jian, jchen@jiangnan.edu.cn

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃項目（2012CB720802，2013CB733602）；國家自然科學基金項目（21390204）。

中圖分類號：Q 815

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）01—0129—11

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151042