接枝聚合物配基的蛋白質吸附層析

余林玲，孫彥

（天津大學化工學院生物化工系，天津 300072）

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接枝聚合物配基的蛋白質吸附層析

余林玲，孫彥

（天津大學化工學院生物化工系，天津 300072）

摘要：以離子交換、親和結合和疏水性吸附為主的蛋白質吸附層析是藥用蛋白質生產過程的核心技術，開發新技術和提高蛋白質吸附層析操作的分離效率（如選擇性和動態吸附容量等）是該領域的主要研究目標。近年來聚合物配基接枝的層析介質由于同時具有較高的吸附容量和傳質速率，得到產學界的廣泛關注。本文針對聚合物配基接枝修飾的蛋白質吸附層析介質的配基化學特征、吸附和傳質特性、層析分離應用和設計等方面進行評述。首先介紹不同種類的聚合物接枝介質，然后系統闡述聚合物配基化學特性對介質吸附和傳質性能的影響機制，并分析上述性質對聚合物配基接枝層析介質分離特性的影響機理和應用，最后討論和展望了高效聚合物配基接枝介質設計、開發和應用的前景。

關鍵詞：蛋白質；吸附；層析；聚合物接枝；配基

2015-07-13收到初稿，2015-08-26收到修改稿。

聯系人:孫彥。第一作者：余林玲（1987—），女，博士，講師。

Received date: 2015-07-13.

引 言

隨著基因工程等生物技術的不斷發展，蛋白質的表達水平大幅提升，使得胰島素、干擾素、生長因子、抗體等蛋白質類生物藥物的廣泛使用成為可能。然而蛋白質具有易失活變性、分離純化工藝流程單元操作多等特點，醫藥產品又對純度要求高，對藥用蛋白質的分離純化技術提出了極高的要求。以離子交換、親和結合和疏水性吸附為主的蛋白質制備層析由于具有分離精度高、分離條件溫和、操作簡單且重復性高等特點，已成為大規模生產藥用蛋白質過程中最常用和使用頻率最高的一項分離純化手段[1-2]。

為了提高蛋白質制備層析的分離性能、實現高效化生產，研究者們對蛋白質吸附層析技術中的核心——層析介質（吸附劑）不斷地探索研究，開發了表面薄殼層析介質（pellicular particles）[3]、觸須型層析介質（tentacle-type resins）[4-6]、流通層析介質[flow-through media[7]，又稱灌注層析介質(perfusion media)[8-9]，包括雙孔層析介質(bidisperse porous media)[10-12]和凝膠殼層層析介質(“gel in a shell”particles)[13-16]等]等層析介質。觸須型層析介質等是通過改造介質基質表面的功能性配基的物理化學性質，從而提高蛋白質在介質中的平衡吸附容量[17]；表面薄殼層析介質、流通層析介質等則是通過改造介質基質的基本結構，改善流動相在介質內部的流動行為以及介質的耐壓性，從而提高蛋白質在介質內部的傳質性能[7, 9, 14]。然而，對于層析技術而言，只有在上柱操作中的高流速下具有的較高動態吸附容量（dynamic binding capacity, DBC）才對蛋白質的分離純化具有實際使用意義，而這則需要同時具有較高的平衡吸附容量和較快的傳質速率才能實現。

近年來，以葡聚糖接枝的瓊脂糖離子交換層析介質為代表的聚合物配基修飾的層析介質得到了產學界的廣泛關注。相較于傳統的短鏈配基修飾的層析介質[功能性基團通過間隔臂直接修飾在介質基質表面，圖1(a)]而言，聚合物鏈配基修飾的層析介質[部分或全部的功能性基團位于聚合物鏈上，功能化的聚合物鏈接枝于介質基質表面，圖1(b)～(e)]通常同時具有較高的平衡吸附容量和傳質速率[18-23]，因而也具有較高水平的DBC[24-26]，極大地提升了層析操作的分離性能。由此，聚合物配基修飾的層析介質的設計和高效吸附傳質機理的解析和應用也成為了蛋白質層析中的研究熱點。

圖1 蛋白質層析介質的基本結構Fig. 1 Schematic diagram of surface structures of resins for protein chromatography

本文針對蛋白質層析中聚合物配基修飾介質在近年來的研究進展進行評述，首先介紹了不同種類的聚合物配基接枝介質，然后系統闡述聚合物配基化學特征對介質的吸附和傳質性能的作用機制，并分析上述性質對聚合物配基介質分離特性的影響機理，以及基于該分離特性對介質的應用進行舉例說明，最后討論聚合物配基的理性設計思路和方向，推動高效蛋白質制備層析的理論和技術發展。

1 聚合物配基化學

1.1 葡聚糖接枝介質

葡聚糖是由D-葡萄糖通過a-1,6-糖苷鍵形成的高分子聚合物，基本結構見圖2(a)。葡聚糖通常為分支很少（<5%）的線性直鏈狀分子[27]，相對分子質量通常從4×103到600×103不等。葡聚糖具有良好的親水性、高生物相容性和極低的非特異性吸附性能，是一種優良的蛋白質層析材料。葡聚糖可直接通過交聯作為層析基質（例如Sephadex系列），1997年起GE healthcare公司將它作為層析基質表面的修飾材料，接枝到瓊脂糖基質表面，從而形成了葡聚糖接枝的瓊脂糖介質（Sepharose XL、Streamline XL和Capto等系列）這類商品化的聚合物配基修飾介質。

葡聚糖分子[圖2(a)]內部雖然有很多羥基，但是葡聚糖鏈自身分子尺寸較大、在溶液中呈無規則線團狀[28]，使得葡聚糖鏈內部的羥基由于空間位阻較大，難以與介質基質表面反應。因此在接枝反應中，通常只有葡聚糖鏈兩端的羥基與介質基質表面發生化學反應，多形成單端較少位點固定的接枝鏈[見圖1(b)][18]。同時，由于相對分子質量較大的葡聚糖鏈幾乎呈線狀，所以接枝后在介質孔道內伸展，可形成較厚的接枝層，同時葡聚糖鏈靈活性較強，可在孔道內自由擺動。但由于葡聚糖鏈自身沒有功能性基團，呈電中性，因此它在接枝到介質基質上后，還需要偶聯上功能性基團（例如離子交換基團磺酸基[29]，混合模式基團苯胺咪唑[20]、巰基甲基咪唑[30-31]等），才能吸附蛋白質。這種修飾方法會使得功能性基團隨機分布于介質基質表面和葡聚糖鏈上，如圖1(b) 所示，從而蛋白質可吸附于介質孔道基質表面和靈活的葡聚糖鏈上。這種特殊的結構使得葡聚糖接枝介質表現出了對蛋白質優良的吸附和傳質性能[25, 32-39]，這將在之后的章節中詳細討論。

圖2 聚合物鏈的化學結構Fig. 2 Chemical structures of grafted polymers

1.2 聚乙烯亞胺接枝介質

聚乙烯亞胺[poly(ethylenimine), PEI]是一種高分子陽離子聚電解質，通常為具有眾多分支結構的長鏈，其基本結構見圖2(b)。PEI相對分子質量通常從400到750×103不等，分子中伯、仲、叔胺的理論比例為1:2:1[40]，在較寬的pH范圍內都能解離帶正電（在水溶液中所有氨基完全質子化后的電荷密度為23.3 mequiv.·g-1[41]）。PEI由于可以可逆性吸附帶負電的物質，同時又具有良好的生物相容性，因此被廣泛應用于基因轉移（例如PEI-DNA復合物轉染等[42-43]）和生物制品的分離純化（例如提取肝素[44]、移除細菌內毒素[45]等）。近年來，研究者發現PEI有利于保持酶的活性和增加酶的穩定性，因此PEI也常被用作離子交換配基偶聯于多種基質表面，應用于多種酶的固定化[46-47]和蛋白質（包括酶蛋白）的離子交換層析[23, 48-50][圖1(c)]。此外，近期本課題組將PEI接枝的瓊脂糖介質二次修飾（在PEI接枝鏈上修飾疏水基團苯甲?；鵞51]、正丁基[52]等），將其應用拓展于蛋白質的混合模式層析分離中。

PEI的結構與1.1節中介紹的葡聚糖具有相似之處：兩者均為相對分子質量較大的長鏈聚合物，具有良好的生物相容性，均在溶液中呈現無規則線團狀。然而，兩者又具有不同之處：PEI分子分支較多且較長、呈樹枝狀長鏈[40, 53]，通常以多位點連接于介質基質表面[49][圖1(c)]；而葡聚糖分子分支較少且較短、呈直線性長鏈，通常由鏈末端的單位點連接于介質基質表面[18]。所以，接枝于介質基質表面的PEI鏈的靈活性（在孔道內的可擺動程度）低于葡聚糖[23]，而且PEI接枝層的伸展性（接枝層厚度的變化程度）也低于葡聚糖接枝層（PEI接枝層不易塌縮）[21]。同時，由于PEI在溶液中的伸展狀態與PEI濃度直接相關（濃度越低，結構越伸展），因此也影響了PEI接枝時的反應位點數（結構越伸展，反應位點數越多）[41, 49, 54]；而葡聚糖接枝時的反應位點數與濃度基本無關（只與鏈末端單位點反應）。此外，由于PEI自身帶正電，PEI接枝介質的離子交換基團只分布于PEI接枝層，如圖1(c)所示，蛋白質只吸附于PEI接枝鏈上，不同于葡聚糖接枝介質中蛋白質可同時存在于介質基質表面和葡聚糖鏈上。因此，PEI接枝介質中，PEI接枝密度（離子交換容量）對蛋白質吸附和傳質行為的影響，直接體現了介質中接枝層的作用，排除了葡聚糖接枝介質中配基分布的影響。

上述相似與不同之處也使得PEI接枝介質不但具有接枝介質的一般吸附性質（高吸附容量和高傳質速率）[23]，也具有自身的吸附特性（存在臨界離子交換容量或臨界接枝密度[23, 55]和高耐鹽性[21, 51]等）。PEI接枝介質對蛋白質的吸附特性也將在之后的章節中詳細討論。

1.3 聚（4-乙烯吡啶）接枝介質

聚（4-乙烯吡啶）[poly(4-vinylpyridine), P4VP]是一種線性長鏈高分子聚合物，其基本結構如圖2(c)所示，相對分子質量通常從4×103到160×103不等。由于吡啶基團可與蛋白質通過多種作用模式發生相互作用[56-57]，且易修飾于多種基質表面，P4VP又具有生物相容性好、價格低廉等特點，所以P4VP被廣泛應用于蛋白質分離領域[58-59]。近期，本課題組考慮P4VP的主鏈為疏水性的烷基鏈、短側鏈為可解離帶正電的吡啶基團，且其單體結構與商品化混合模式層析介質MEP-HyperCel相似，也將P4VP作為聚合物鏈配基接枝于瓊脂糖基質上，開發了一系列混合模式層析介質[60]。

P4VP和1.2節中介紹的PEI有相似之處：兩者均為相對分子質量較大的長鏈聚合物，具有良好的生物相容性，均在溶液中呈現無規則線團狀，可與介質基質表面多位點反應，且自身帶功能性基團，均可解離帶正電、接枝后介質的離子交換基團只分布于接枝鏈上。兩者的不同之處也很多：P4VP為無分支的線性長鏈，相對分子質量相同時其鏈長度遠大于PEI鏈，分子內同時存在靜電作用和疏水作用，多位點修飾后會形成相互纏繞的接枝鏈和結構較緊實的、較不伸展的接枝層，而固定于基質表面的吡啶基團上的胺基季胺化[58, 61]，帶上較多正電荷，排斥P4VP長鏈，使接枝層保持了一定的伸展性，不至于完全塌縮[60][圖1(d)]；而PEI呈樹枝狀長鏈，各個分支均帶正電相互排斥，修飾于介質基質表面后形成伸展的、不易塌縮的接枝層。此外，P4VP長鏈中各個自由吡啶基團的可解離程度相似，離子交換基團（帶電基團）均勻分布于P4VP長鏈中；而PEI中各個伯、仲、叔胺的解離性質差別較大、分布不均，因此離子交換基團在PEI鏈中分布不均 [40, 62-63]。

P4VP接枝介質的獨特的接枝層形態[圖1(d)]、接枝鏈的疏水和靜電性能以及功能性基團分布[圖2(c)]使其具有不同于葡聚糖接枝介質和PEI接枝介質的吸附與傳質特性，例如可在500 mmol·L-1NaCl條件下對γ-球蛋白的高效吸附和對γ-球蛋白和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的溫和洗脫等[60]，這也將在之后的章節中詳細討論。

1.4 團簇型電荷修飾介質

團簇型電荷修飾介質（clustered-charge resin）是一類以寡聚氨基酸及其衍生物為功能性配基的介質，結構如圖1(e)所示，可用于多種蛋白質和核酸的分離純化[22, 64-67]。在團簇型電荷修飾介質中，通常由賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸五聚體的酰胺衍生物[64, 67]以及精胺[66][1,12-二氨基-4,9-二氮十二烷，結構如圖2(d)所示]作為介質的離子交換配基。此類團簇型電荷配基的電荷密度較高、相對分子質量較低，呈現一種納米級別的短鏈聚電荷團簇。

該聚電荷團簇短鏈與前文介紹的PEI鏈、P4VP鏈也有一些相同之處：均具有良好的生物相容性，均可解離帶正電、接枝后介質的離子交換基團只分布于接枝鏈上。它們的不同之處在于：聚電荷團簇短鏈中各個氨基的可解離程度相似且均較高[66]，因此離子交換基團均勻分布于該聚電荷團簇短鏈中且密度較高[64]；P4VP鏈中離子交換基團雖分布均一但密度相對較低，而PEI鏈中的離子交換基團分布不均且密度相對較低[40, 62-63]。而且，聚電荷團簇短鏈相對分子質量較低（僅3～5個重復單元），電荷密度較高，修飾于介質基質表面后形成的接枝層很薄，短鏈也幾乎不能在孔道內自由擺動，這與葡聚糖和PEI接枝后的自由長鏈和較厚接枝層有著較大區別。

這種局部電荷密度較高的團簇結構使得團簇型電荷修飾介質具有不同于傳統短鏈配基介質和葡聚糖、PEI接枝介質、P4VP接枝介質等長鏈配基接枝介質的吸附與傳質特性[67]，例如，對蛋白質局部電荷密度變化的高敏感性[64]，這也將在之后的章節中詳細闡述。

2 吸附性能

2.1 吸附平衡

正如在前文中提到的，當離子交換容量相近或略高時，葡聚糖接枝介質、PEI接枝介質這兩類長鏈聚合物配基修飾介質以及團簇型電荷修飾介質這類短鏈聚合物配基對蛋白質的平衡吸附容量均高于傳統短鏈配基介質[18, 21, 23, 29, 39, 55, 64, 66, 68-70]。例如，

商品化傳統短鏈配基修飾的瓊脂糖介質SP Sepharose FF（介質基質為6%的交聯瓊脂糖Sepharose FF，其表面修飾磺酸基，配基密度200 mmol·L-1）在10 mmol·L-1的磷酸-磷酸氫二鈉溶液中（pH 6.5）對溶菌酶的平衡吸附容量僅為230 mg·ml-1，而同樣條件下的商品化葡聚糖接枝的瓊脂糖介質SP Sepharose XL（介質基質為Sepharose FF，其表面接枝葡聚糖后再修飾磺酸基，配基密度220 mmol·L-1）高達 400 mg·ml-1[19]。類似的，PEI接枝的瓊脂糖介質FF-PEI-L260也比其相對應的商品化傳統短鏈配基修飾瓊脂糖介質Q Sepharose FF對BSA的平衡吸附容量高20%以上[21]；P4VP接枝的瓊脂糖介質FF-P4VP-190，比其對應的商品化傳統短鏈配基修飾瓊脂糖介質MEP-HyperCel對γ-球蛋白和BSA的平衡吸附容量高20%以上[60]；五聚賴氨酸接枝的瓊脂糖介質（pentalysinamide aldehyde agarose）對Ca2+缺失α-乳清蛋白的吸附平衡容量可由傳統分散型賴氨酸配基修飾瓊脂糖介質（lysinamide aldehyde agarose）的0.24 μmol·ml-1提升至0.48 μmol·ml-1[64]。

2.1.1 長鏈聚合物配基修飾介質的高吸附容量原理目前普遍認為葡聚糖、PEI、P4VP等長鏈聚合物配基修飾介質對多種蛋白質表現出的高水平的平衡吸附容量是源于接枝于介質基質表面的長鏈聚合物可在介質孔道內自由擺動，并形成了伸展的接枝層[29, 36, 68]。因此，蛋白質更易接近聚合物長鏈上的功能性基團（例如帶電基團），可靈活地與其發生相互作用，使蛋白質的吸附位點從傳統短鏈配基修飾介質的吸附平面[圖1(a)]拓展到整個接枝層的三維吸附空間[20, 23, 39][圖1(b)、(c)]，提高了功能性基團的利用率，從而有利于蛋白質吸附，提升平衡吸附容量。P4VP這種線性長鏈聚合物配基，在修飾密度較高時，由于分子極長，即使鏈間和鏈內纏結后，形成的接枝層還是較伸展，可以提供一定的三維吸附空間[圖1(d)]，同時功能性基團數量多、作用方式多樣，因此也十分有利于蛋白質吸附，接枝介質具有較高的平衡吸附容量[60]。

（1）葡聚糖接枝介質

由于葡聚糖接枝的離子交換層析介質中的葡聚糖接枝鏈分支少、接枝層較伸展、接枝層的電荷密度較低，因此在加鹽屏蔽電荷后，接枝層極易塌縮，并屏蔽吸附位點，不利于蛋白質吸附，導致介質吸附容量隨鹽濃度提升而急劇降低，即對鹽濃度的敏感程度極高（高于傳統短鏈配基介質）[21, 29, 39]。同時，由于葡聚糖接枝鏈相對分子質量較大、分支少、易塌縮，在修飾疏水性基團[20]后，接枝鏈通過疏水相互作用纏繞結合，接枝層快速塌縮，無法提供三維吸附空間，會喪失聚合物配基接枝介質的吸附優勢。因此，葡聚糖接枝介質不適宜拓展到疏水相互作用層析和混合模式層析中。

（2）PEI接枝介質

由于PEI接枝鏈不但分支眾多、接枝層不如葡聚糖層伸展，而且PEI接枝層的電荷密度較高，在加鹽屏蔽電荷后，接枝層不易塌縮，因此PEI接枝介質對鹽濃度的敏感程度較低（低于傳統短鏈配基介質和葡聚糖接枝介質，在200～300 mmol·L-1NaCl時還能保持較高的吸附容量）[21]。同時，由于PEI鏈較葡聚糖鏈不易塌縮，在PEI接枝鏈上修飾疏水基團苯甲?；鵞51]、正丁基[52]等形成的PEI接枝的混合模式層析介質，也可形成一定厚度的接枝層，以提供一定的三維吸附空間，有利于蛋白質吸附，在較寬的鹽濃度范圍（0～2 mol·L-1NaCl）具有較高的吸附容量[51-52]。

（3）P4VP接枝介質

P4VP接枝介質則正如之前提到的，在修飾密度較高時，由于介質中的功能性基團數量多、與蛋白質的作用方式多種，因此可在不同條件下以不同作用模式吸附蛋白質；同時較厚的接枝層結構較緊實，在高鹽下也不易塌縮，可以提供一定的三維吸附空間，有利于較寬鹽濃度范圍（0～500 mmol·L-1NaCl）的蛋白質吸附[60]。另外，P4VP接枝介質和PEI接枝的混合模式層析介質類似，其接枝層厚度與pH密切相關（pH越低，基團解離程度越高，鏈越伸展，接枝層越厚），對蛋白質可進入的孔道和三維吸附空間影響極大，也造成了不同pH條件下蛋白質的吸附差異性較大[51-52, 60]，為混合模式層析分離提供良好基礎，這將在下一節中詳細討論。

2.1.2 團簇型電荷修飾介質的高吸附容量原理 然而，對于團簇型電荷修飾介質而言，由于其聚合物配基鏈較短，無法形成伸展的接枝層，因此幾乎不存在有利于蛋白質吸附的三維吸附空間。但團簇型電荷修飾介質中具有多個納米級聚電荷團簇[圖1(e)]，該團簇局部電荷密度高，內部電荷分布均一，易于與多種蛋白質中的用以蛋白-蛋白或者蛋白-核酸識別的保守區域（該區域通常也具有高電荷密度[71]，例如α-乳清蛋白的兩個亞基交界處是特異性結合Ca2+離子域的保守區域，富含天冬氨酸，局部帶大量負電荷）的多位點發生相互作用，蛋白質與吸附位點間的結合部位更多，具有更高的初始結合親和性[64, 67]，從而強化了蛋白質吸附行為，提高平衡吸附容量。但是，當蛋白質的保守區域發生改變（例如α-乳清蛋白的保守區域被Ca2+飽和、細胞色素b5保守區域被突變但凈電荷不變）時，團簇型電荷修飾介質的平衡吸附容量急劇下降，表現出了對蛋白質局部結構變化的高度敏感性[64]。由于研究者們主要關注團簇型電荷修飾介質的吸附平衡容量及其對蛋白質結構的敏感性[22, 64-67]，而對蛋白質的傳質速率研究較少，所以對團簇型電荷接枝介質就不再討論其吸附動力學。

2.2 吸附動力學

2.2.1 離子交換層析介質 在具有較高平衡吸附容量的同時，蛋白質在葡聚糖接枝介質和PEI接枝介質這兩類長鏈聚合物配基修飾的離子交換層析介質中傳質速率也遠高于傳統短鏈配基介質[18-21, 23, 29, 37-38, 55, 68, 70, 72-74]。在相同條件下，溶菌酶在商品化葡聚糖接枝介質SP Sepharose XL中的有效孔擴散速率（De）可達其在商品化傳統介質SP Sepharose FF中的4.7倍[19]。溶菌酶在葡聚糖接枝的瓊脂糖介質SP-T40-X-S6B中甚至高達自由溶液擴散速率（D0）的10倍[18, 29]，而蛋白質在多孔介質中的De值通常應低于D0值。BSA在PEI接枝的瓊脂糖介質FF-PEI-L740中的De值也達到了其在自由溶液中D0值的1.6倍[21]。

研究者們對造成蛋白質在上述兩類長鏈聚合物配基修飾的離子交換層析介質中的De/D0>1現象的原理進行了深入探究，目前較為廣泛接受的有如下幾種機理[75]。一類是，在上述長鏈聚合物配基修飾介質中存在表面擴散[包括“活性跳躍(activated jump)”[19, 32, 76]和“鏈傳遞(chain delivery effect)”[21, 23, 55]等機理]，表面擴散對傳質的貢獻使得通過孔擴散模型擬合得到的De值（集總的動力學參數）偏大。另一類是，在上述介質中存在電動效應等非擴散機理（包括電泳[20, 77]、電滲[77]、靜電耦合[29]等）促進孔內傳質，也使得擬合得到的De值偏大?？偟膩碚f，研究者們均認為在上述介質中存在孔擴散之外的傳質機理對介質內部的蛋白質傳遞過程做出較大貢獻。由于這些機理已在近期的綜述文章[75]中進行了詳細的評述，所以在此不再贅述，只簡要地闡述其中的鏈傳遞機理。

（1）鏈傳遞機理

圖3 鏈傳遞機理[75]Fig. 3 Schematic drawing for mechanism of chain delivery effect[75](The blue circles represent adsorbed protein, and the dashed dark green lines as well as the faded circles represent the grafted polymers chains with adsorbed proteins after swing. The dashed pink boxes highlight the sites for the “relay”/delivery of protein. Other symbols in this figure are the same as in Fig.1)

鏈傳遞機理可通俗地用“救火列隊作用（bucket brigade effect）”[35]描述，是一種特殊的表面擴散，只存在于具有可自由擺動的聚合物鏈配基修飾介質中[21, 23, 55, 70, 75]，機理如圖3所示。本課題組在研究蛋白質PEI接枝介質中傳質速率在臨界接枝密度（臨界離子交換容量）處快速增加[23, 55][圖4(a)]時，對這個機理進行了詳細闡述。簡而言之，靈活的長鏈聚合物配基可在孔道內自由擺動，當入口處的聚合物長鏈上吸附蛋白質后，聚合物長鏈會在朝向介質中心的化學勢和由被吸附蛋白質為媒介的鏈間作用驅動下，向孔道內部擺動，將該蛋白質運送并轉移到鄰近的聚合物長鏈上（圖3），類似于在火災時救火人員列隊傳遞接力水桶。由此，吸附相蛋白質通過自身為媒介，通過聚合物長鏈的擺動，被動地在介質表面的吸附位點上移動。

圖4 蛋白質在接枝介質中的傳質速率（De/D0值）隨聚合物鏈密度的變化Fig. 4 Effective diffusivities of BSA and γ-globulin on polymer-grafted resins with different grafting densities (a) PEI-grafted resins[23, 55]; (b) dextran-grafted resins[20]

（2）鏈密度對鏈傳遞作用的影響

由于PEI接枝介質中吸附位點只存在于PEI接枝鏈上，所以當接枝密度較低（低于臨界接枝密度）時，相鄰兩條鏈之間的距離太遠，無法發生鏈傳遞作用，蛋白質在介質中的傳質以孔擴散為主，傳質較慢；而當接枝密度較高（高于臨界接枝密度）時，相鄰兩條鏈之間的距離較近，鏈傳遞作用極大地促進了吸附相蛋白質傳質，蛋白質在介質中的傳質速率大幅提升。因此，PEI接枝介質中存在的臨界接枝密度，即為保證蛋白質能在相鄰兩條鏈能發生鏈傳遞作用的距離。上述機理也是造成圖4(a)中PEI接枝介質的De/D0值在臨界離子交換容量處快速增加的原因[23]。然而，由于葡聚糖接枝介質中吸附位點既存在于聚合物接枝鏈上，又存在于介質基質表面的短鏈配基上，所以接枝鏈密度和配基密度（接枝鏈配基和短鏈配基總密度）都對鏈傳遞作用有影響。而在離子交換層析介質的常用配基密度范圍（140～150 mmol·L-1），由于兩類配基間距離較近，聚合物接枝鏈與基質表面的短鏈配基（或聚合物接枝鏈）間始終能發生鏈傳遞作用、促進傳質，從而葡聚糖接枝介質的De/D0值幾乎隨著接枝量線性增加[20][圖4(b)]。

（3）鹽濃度對鏈傳遞作用的影響

由于鏈傳遞作用是一種特殊的表面擴散，因此增加鹽濃度減弱蛋白質與吸附位點間的靜電相互作用，有利于鏈傳遞作用發生。同時，表面擴散通量與吸附相蛋白質密度正相關，鏈傳遞作用對總傳質速率的貢獻也與介質對蛋白質的吸附容量正相關。這兩方面的影響很好地解釋了葡聚糖接枝介質和PEI接枝介質的傳質速率隨鹽濃度變化趨勢不同的現象（圖5）。葡聚糖接枝介質的吸附容量對鹽濃度十分敏感，隨鹽濃度增加急劇下降[36, 39]，因此，鏈傳遞作用的傳質通量急劇下降，導致了總傳質速率隨鹽濃度增加而下降的趨勢[19, 29]。PEI接枝介質的吸附容量對鹽濃度變化不敏感，上述兩方面影響共同作用于鏈傳遞作用，所以總傳質速率呈現隨鹽濃度增加先上升后下降的趨勢[21]。

圖5 蛋白質在接枝介質中的傳質速率（De/D0值）隨鹽濃度的變化（數據源于文獻[19, 21, 29]）Fig. 5 Effective diffusivities of proteins on polymer-grafted resins at different salt concentrations (data from references[19, 21, 29])

2.2.2 混合模式層析介質 對于P4VP和疏水基二次修飾的PEI這兩類具有疏水性的長鏈聚合物配基修飾的混合模式層析介質而言，其接枝鏈形態（靈活性和伸展性等）與接枝量、疏水基修飾密度、緩沖液鹽濃度和pH等密切相關，這也使得其傳質速率呈現更加復雜的趨勢[60]。其傳質速率對緩沖液條件的依賴性也為這兩類介質在層析柱上的操作靈活性和適用范圍廣泛性提供了良好的基礎，這也將在下一節中詳細討論。

3 蛋白質層析

由于上述幾種聚合物配基修飾的介質均具有較高的吸附容量和傳質速率，因此它們都常具有較高的DBC[24-25, 36, 60, 69-70, 72-74]，被用于多種蛋白質的分離純化工藝流程中[78-81]。例如，葡聚糖接枝的離子交換層析介質Q Sepharose XL由于對BSA和單克隆抗體均具有較高的DBC，而這兩種蛋白質的單體和聚集體又可以通過梯度洗脫分離，因此Q Sepharose XL可用于批量化分離BSA和單克隆抗體的單體和聚集體[82]；類似的，Capto Q對12×103聚乙二醇修飾的BSA的DBC高達50 mg·ml-1（流速50 cm·h-1）和37 mg·ml-1（流速250 cm·h-1），實現了乙二醇化的BSA的高效分離[83]；另外，Tugcu 等[79]利用市面上的多種商品化層析介質設計了多種單克隆抗體純化方案，通過對比純化方案和優化純化流程發現，Q Sepharose XL由于DBC較高，其層析操作是單克隆抗體純化的最優流程中不可或缺的重要環節。此外，這些聚合物配基修飾介質的特殊的吸附性能造成其具有各自的層析分離特性，見表1。

3.1 葡聚糖接枝的離子交換層析介質

如前所述，葡聚糖接枝的離子交換層析介質的吸附容量和傳質速率均隨著鹽濃度增加而急劇下降，這導致DBC具有極高的鹽濃度敏感性（在約150 mmol·L-1NaCl條件下就幾乎不吸附蛋白質）[29, 36-37, 84]。因此，該類介質適宜于在低鹽條件下（0～100 mmol·L-1NaCl）的蛋白質吸附；同樣，約150 mmol·L-1NaCl可作為洗脫條件，賦予了它較傳統短鏈配基介質的低鹽高效洗脫優勢[72]。所以，葡聚糖接枝的離子交換層析介質通常用于0～150 mmol·L-1NaCl緩沖液條件下的蛋白質高容量吸附與低鹽高效洗脫[85-86]（表1）。

3.2 PEI接枝的離子交換層析介質

相比之下，PEI接枝的離子交換層析介質的DBC對鹽濃度的敏感程度則較低[24]（遠低于傳統短鏈配基介質和葡聚糖接枝介質，這是由于其鏈內靜電作用不易被屏蔽、接枝層不易塌縮所致，例如FF-PEI-L740在200 mmol·L-1NaCl時還能同時具有較高的吸附容量和傳質速率[21]因而具有超過60 mg·ml-1的DBC[24]）。所以，PEI接枝的離子交換層析介質適用于較寬鹽濃度范圍（0～300 mmol·L-1NaCl）內的蛋白質吸附，其洗脫條件為約400 mmol·L-1NaCl[21, 24]（表1）。同時，PEI接枝的離子交換層析介質對流動相反離子種類也有較高的偏好性（不同的親和能力），例如FF-PEI-L680對反離子的偏好性隨SCN-

3.3 PEI接枝的混合模式層析介質

表1 蛋白質層析介質的分離特性Table 1 Separation characteristics of resins for protein chromatography

在接枝密度較低的PEI接枝的離子交換層析介質的PEI鏈上，修飾疏水基團苯甲?；鵞51]、正丁基[52]等，形成了PEI接枝的混合模式層析介質，也顯示了很好的蛋白質層析分離應用前景。例如，苯甲?；揎椀腜EI接枝的混合模式層析介質B160-PEI330在0.5～2 mol·L-1NaCl條件下可保持恒定的吸附容量和傳質速率，因此可提供較高的DBC，并表現了極好的耐鹽性；該介質在pH 3條件下可以對BSA和γ-球蛋白完全洗脫，而在pH 4時BSA和γ-球蛋白的洗脫收率差異極大（8% v.s. 71%）[51]。上述耐鹽性和洗脫差異性可應用于從含有白蛋白的混合物（例如血清）中分離抗體（表1）。但接枝密度較高的PEI接枝的混合模式層析介質，則由于其在低pH洗脫時的鏈內靜電排斥作用太強，形成接近剛性的接枝鏈，將孔道堵塞，阻礙蛋白質從介質內部擴散出來，造成洗脫回收率較低，因而不適用于混合模式層析分離[51]。

3.4 P4VP接枝的混合模式層析介質

P4VP接枝的混合模式層析介質則由于具有特殊的接枝鏈形態以及接枝鏈形態（厚度和帶電性等）對pH的高度敏感性，可在pH 4～4.5實現對蛋白質的完全洗脫[60]，比現今報道過的大多數混合模式層析的洗脫條件都溫和[57, 88-89]，這也顯示了P4VP接枝介質在結構敏感型蛋白質的層析分離中的應用前景（表1）。

3.5 團簇型電荷修飾介質

如2.1節中所述，團簇型電荷接枝介質對具有保守的高電荷密度區域的蛋白質的吸附具有較高的吸附容量和選擇性，且吸附容量對蛋白質結構具有極高的敏感性[64, 87]，對鹽濃度也極敏感[66]，因此團簇型電荷接枝介質可用于此類蛋白質的高分辨率分離（表1）。

4 展 望

通過上述對不同種類的聚合物配基的化學特征、吸附和傳質特性、層析分離特性和應用的系統闡述，總結了聚合物配基影響介質的蛋白質層析行為的作用機理。這些討論也為今后的聚合物配基的理性設計提供了研究思路和方向。例如，對于長鏈聚合物配基而言，靈活、伸展的聚合物長鏈配基更有利于蛋白質的三維吸附和鏈傳遞作用，所以新型層析配基的理性設計應重點開發相對分子質量較大、分支較少、電荷密度較低的長鏈聚合物配基以提升吸附容量和傳質速率。電荷密度較高的長鏈聚合物配基，雖不靈活，但耐鹽性高，所以適用于高鹽條件下的分離純化。具有疏水性的長鏈聚合物配基則需謹慎考慮其疏水性和帶電性的比例以及疏水性和伸展性的關系（聚合物鏈上疏水基團增加一方面會增加蛋白質吸附位點總數，另一方面會造成鏈纏繞、接枝層塌縮、掩蔽吸附位點、減少可被蛋白質利用的吸附位點），使這類聚合物配基適用于蛋白質混合模式吸附層析。而對于團簇型短鏈配基而言，電荷密度越高、電荷分布越均一的團簇型電荷配基更有利于對具有保守的高電荷密度區域的蛋白質的高分辨率吸附。此外，蛋白質層析的聚合物鏈配基研究還有很多不足，例如葡聚糖接枝介質中功能性基團的分布（葡聚糖接枝鏈配基和基質表面短鏈配基的分布）對吸附和傳質的影響仍不清楚；團簇型短鏈配基的相對分子質量和帶電基團在短鏈中的分布（團簇短鏈自身的電荷密度）對吸附和傳質的影響，團簇型短鏈配基能否拓展到混合模式吸附層析，團簇型短鏈配基能否應用于更廣泛的蛋白質高分辨率分離等問題仍需研究。最后，利用分子模擬方法研究和解析表面聚合物配基結合蛋白質的分子傳遞（鏈傳遞行為），將為聚合物配基設計提供理論基礎，進一步推動蛋白質吸附層析技術的發展。

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Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21236005).

Adsorptive protein chromatography with grafted polymeric ligands

YU Linling, SUN Yan
(Department of Biochemical Engineering and Key Laboratory of Systems Bioengineering of the Ministry of Education, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Abstract：Adsorptive protein chromatography, mostly based on ion exchange, affinity binding and hydrophobic interactions, is the key technology in the large-scale production of therapeutic proteins. The development of novel technology as well as improvement of chromatographic separation efficiency, such as dynamic binding capacity and selectivity, is generally the main objective of fundamental studies on protein chromatography. Recently, polymeric ligand-modified matrices have been developed and widely studied due to the findings that some of them not only possess high equilibrium adsorption capacity but also high uptake rate. This review is devoted to an overview of the polymeric ligands for protein chromatography. Different kinds of polymeric ligands are first introduced. This is followed by the effects and functional mechanisms of the polymeric ligand chemistry on protein adsorption equilibria, uptake kinetics as well as separation performance of the ligand-modified matrices. Applications of the matrices based on the mechanisms are then illustrated to offer insight into the design of new polymeric ligands. Finally, a perspective for further development and fundamental studies on polymeric ligand-based protein chromatography is discussed.

Key words：protein; adsorption; chromatography; polymer grafting; ligand

Corresponding author:Prof. SUN Yan, ysun@tju.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金項目（21236005）。

中圖分類號：TQ 033

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）01—0140—12

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151120