RP-HPLC測定伊赫烏蘭-13中的氧化苦參堿

鄒繼紅，王洪斌，趙春杰（.赤峰學院　醫學院，內蒙古　赤峰　04000；.赤峰市傳染病防治醫院，內蒙古　赤峰　04000；.沈陽藥科大學　藥學院，遼寧　沈陽　006）

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RP-HPLC測定伊赫烏蘭-13中的氧化苦參堿

鄒繼紅1，王洪斌2，趙春杰3
（1.赤峰學院醫學院，內蒙古赤峰024000；2.赤峰市傳染病防治醫院，內蒙古赤峰024000；3.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽110016）

摘要：目的：建立RP-HPLC測定伊赫烏蘭-13中氧化苦參堿含量的方法.方法：采用Shim-pack CLC-ODS柱，流動相為甲醇-0.1%三乙胺=3∶8（磷酸調pH至3.0），檢測波長為210nm，流速為1.0mL·min-1.結果：氧化苦參堿的濃度在4.04～40.4μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性，回歸方程為：Y＝40.113X+0.2584，（r＝0.9997）；平均加樣回收率為99.1%，RSD= 1.6%（n=9）.結論：所用方法簡便、快速、準確，適用于伊赫烏蘭-13中氧化苦參堿的質量控制.

關鍵詞：RP-HPLC；伊赫烏蘭-13；氧化苦參堿；含量測定

蒙藥伊赫烏蘭-13由土木香、苦參、梔子、茜草、懸鉤子木、山柰、訶子、川楝子、枇杷葉、紫草茸、橡子、紫草、金蓮花組成，具有清血熱之功效，臨床上主要用于頭痛、血熱上盛、目赤、高血壓等病癥[1].作者查閱相關文獻，未見測定方中主藥苦參的活性成分氧化苦參堿的含量的相關報道，為了有效控制該制劑的內在質量，作者以氧化苦參堿的含量作為測定指標，采用RP-HPLC測定，方法學驗證結果表明方法簡便，結果準確，其它組分不干擾氧化苦參堿的測定，可作為伊赫烏蘭-13的質量控制方法.

1　儀器與試劑

1.1儀器

FA2104N電子天平；美國Agilent 1200高效液相色譜儀；UV759紫外可見分光光度計.

1.2試劑

氧化苦參堿對照品（批號110780-201408，購自北京中國藥品生物制品檢定所，含量為99.9%）；分析純試劑磷酸和三乙胺；色譜甲醇；娃哈哈純凈水.蒙藥伊赫烏蘭-13（由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室制備，批號：20140805、20141004、20141106）；陰性對照品的藥材（購自內蒙古赤峰市中蒙醫院）.

2　方法與結果

2.1色譜條件

Shim-pack CLC-ODS色譜柱(250mm×6.0 mm，內徑5μm)；柱溫：室溫；流動相為甲醇-0.1%三乙胺（3∶8，用磷酸調節pH至3.0）；檢測波長：210nm；流速：1.0mL·min-1；進樣體積為20μL.

2.2對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液的制備

取氧化苦參堿對照品，精密稱取5.05mg，置于25mL量瓶中，加流動相溶解，稀釋至刻度，制得202μg·mL-1氧化苦參堿的對照品儲備液.吸取儲備液1.0mL，置于10mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即為20.2μg·mL-1氧化苦參堿的對照品溶液.

取已研細的伊赫烏蘭-13細粉4.0g，精密稱定，置于250mL具塞錐形瓶中，加入0.1mL氨水，25mL無水乙醇，密塞，超聲溶解30min，放冷至室溫，用濾紙濾過，濾器與錐形瓶用無水乙醇洗滌4次，每次5mL，將濾液與洗液合并，并于水浴上蒸干，蒸干的殘渣用流動相溶解，并定容至10mL.再用0.45μm微孔濾膜濾過，制得供試品溶液.

依據伊赫烏蘭-13的處方要求，制備不含苦參堿的樣品，按制備供試品溶液同樣的方法進行制備，濾過，制得陰性樣品溶液.

2.3專屬性試驗

分別吸取20μL陰性樣品溶液、氧化苦參堿對照品溶液和供試品溶液，在“2.1”項的色譜條件下，注入高效液相色譜儀，所得圖譜如圖1所示.由圖可以看出：陰性樣品不干擾氧化苦參堿的測定，氧化苦參堿的保留時間約4.3min左右，與其他組分可達到基線分離.

2.4穩定性考察

吸取20μL同一份供試品溶液，分別于室溫放置0、1、2、4、6、8、10h時注入高效液相色譜儀，測定氧化苦參堿的峰面積，RSD=1.9%，表明供試品溶液在10h內穩定，滿足測定要求.

2.5重復性考察

取同一批伊赫烏蘭-13樣品（批號20141106），精密稱取適量，按“2.2”的方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項的色譜條件下，將供試品溶液注入高效液相色譜儀，測定氧化苦參堿的峰面積，計算可得平均含量為0.056mg·g-1，RSD=1. 8%，說明方法的重復性很好.

圖1　高效液相色譜圖

2.6精密度考察

分別吸取20μL供試品溶液和氧化苦參堿對照品溶液，注入高效液相色譜儀，測定氧化苦參堿的峰面積，重復測定6次，樣品的RSD=1.5%，對照品的RSD=0.9%，說明儀器的精密度很好.

2.7線性范圍考察

在6個50mL量瓶中，分別加入氧化苦參堿對照品儲備液1.0、2.0、6.0、8.0、10.0mL，加流動相稀釋刻度，得到6個濃度的苦參堿對照品溶液.分別吸取6個對照品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，測定氧化苦參堿的峰面積.以峰面積為縱坐標，氧化苦參堿的濃度（μg·mL-1）為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程為:Y=40.113X+0.2584，（r=0. 9997）.結果表明氧化苦參堿濃度在4.04～40.4μg·mL-1范圍內與峰面積有良好的線性關系.

2.8加樣回收率試驗

分別精密稱取9份氧化苦參堿含量已知的同一批（批號20141106，含量為0.056mg·g-1）樣品粉末3.0g，依次加入202μg·mL-1的氧化苦參堿對照品儲備液0.6、0.8和1.0mL，按“2.2”項下的方法進行處理，吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測定氧化苦參堿的峰面積，計算回收率，結果如表1所示.

2.9樣品的測定

取3個批號樣品（20140805、20141004、20141106），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取20μL氧化苦參堿對照品溶液和3份供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定氧化苦參堿的峰面積，按外標法計算氧化苦參堿的含量，結果3批樣品的平均含量分別為0.054、0.057和0.058 mg·g-1.

表1　加樣回收率結果（n=9）

3　討論

試驗過程中，采用UV-759紫外-可見分光光度計掃描氧化苦參堿的紫外吸收光譜圖，最大吸收波長為206nm，而甲醇的截止波長為210nm，導致測量結果偏高，故選取檢測波長為210nm，可消除甲醇的干擾，保證氧化苦參堿的色譜峰基線平穩.選擇流動相時，作者參考部分相關文獻，嘗試采用乙腈-無水乙醇-磷酸溶液[2]、乙腈-水[3]、乙腈-磷酸二氫鉀-十二烷基硫酸鈉-水[4]、磷酸-甲醇[5]作為流動相，發現氧化苦參堿的色譜峰嚴重拖尾或與其他組分無法完全分離.經過反復多次試驗，最后當采用甲醇-0.1%三乙胺（3∶8，磷酸調pH至3.0）時，氧化苦參堿峰的對稱因子符合要求，與其他組分的分離度良好.蒸干溶劑后分別采用無水乙醇和流動相溶解殘渣，通過反復試驗發現流動相溶解的樣品中氧化苦參堿的色譜峰與其他組分的色譜峰分離度均≥1.5，且譜圖干凈，故最終采用流動相溶解殘渣.

參考文獻：

〔1〕白清云.中國醫學百科全書·蒙醫學[M].上海:上海科技出版社，1992.260.

〔2〕任永紅，馮紹華.HPLC法測定康婦靈片中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].安徽醫藥，2009，13（2）：154-155.

〔3〕梁燕，屈蓉，劉華章.HPLC法測定消炎止痢靈片中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].藥學進展，2008，32（11）：509-512.

〔4〕劉燕，曲延偉，劉園華.高效液相色譜法測定痔痛安軟膏中苦參堿與氧化苦參堿的含量[J].食品與藥品，2009，11 （3）：38-40.

〔5〕江海，吳三橋，江珊，等.苦參和狼牙刺植株中苦參堿與氧化苦參堿的含量測定[J].湖北農業科學，2009，48（12）：3136-3138.

基金項目：內蒙古自治區自然科學基金項目資助（2013MS1217）

收稿日期：2015-09-24

中圖分類號：R927.2

文獻標識碼：A

文章編號：1673-260X（2016）01-0019-02