獼猴桃60Co-γ射線輻射誘變植株變異的ISSR分子標記研究

劉平平，葉開玉，龔弘娟，王發明，莫權輝，蔣橋生，李潔維

(廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

獼猴桃60Co-γ射線輻射誘變植株變異的ISSR分子標記研究

劉平平，葉開玉，龔弘娟，王發明，莫權輝，蔣橋生，李潔維*

(廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

分析不同輻射處理后“長果”獼猴桃(Actinidialongicarpa)樣本的變異性，為獼猴桃誘變育種及加快獼猴桃育種進程提供理論基礎。采用0 (CK)、40、60、80和100 Gy60Co-γ射線輻射處理“長果”獼猴桃接穗后，用ISSR分子標記技術對5種處理后的55個樣品的多態性進行研究。結果表明：從100條寡聚核苷酸引物中篩選出7條引物進行標記，平均每條引物擴增出14.3條帶，其中6.7條多態性帶，多態性比率為46.85 %；遺傳相似系數為0.79～1.00，聚類分析表明，第Ⅴ類為60Gy 6～8號植株，與對照的遺傳距離最遠，變異程度最大。因此，輻射誘變可導致獼猴桃發生顯著的遺傳變異，利用ISSR分析方法，可準確測定輻照樣本是否為突變體。

“長果”獼猴桃；輻射；誘導；變異；ISSR；突變體

輻射誘變具有可以產生小量突變，在改良品種的同時對原有優異性狀的影響較小等優良特性，是離體誘變育種技術常用的方法之一[1]。目前，輻射誘變最常用最普遍的處理方法是以固定的60Co-γ輻射源裝置一次急性照射試材[2]。突變育種技術始于20世紀50年代[1，3]，我國果樹的輻射育種工作始于20世紀60年代[1-2，4]，目前已在20多種果樹上獲得應用[5-6]，并取得較大的成就。輻射誘變在獼猴桃育種也有相關報道。胡延吉等[7]用60Co-γ射線處理2個獼猴桃品種幼芽選育出2個各具特色的新品系。

目前，對輻射誘變分子機理的研究主要包括兩個方面：一是以個別性狀發生變異的突變體為材料，從分子水平和蛋白質水平尋找引發性狀變異的基因，例如Mao等[8]和Biswas等[9]分別就2個擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體進行深入研究，發現了導致突變的控制基因；Yan 等[10]研究發現bc7(t)的脆性突變就是由于OsCesA4基因發生了堿基刪除造成的。二是利用分子標記和蛋白質電泳分析DNA變異的研究，可快速準確的從DNA水平研究輻射誘變效應，如李娜等[11]對誘變粳稻9522篩選出1株帶有白色中脈的隱性單位點突變的Oswm突變體，通過2種分子標記最終將導致突變的基因精細定位在水稻4號染色體約為122 kb基因上；郭建輝[12-13]等，王陽等[14]，賈月慧等[15]和章寧等[16]應用RAPD分子標記，分別對輻照誘變后發生突變的香蕉新株系漳蕉8號，花朵變異的百合(Liliumspp. )，9個亞洲百合(Asiatic lily)‘pollyanna’基因型突變體及蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrid)誘變苗等與原株系對照，發現不同的突變體均發生基因突變；邢莉莉等[17]通過ISSR分子標記技術分析發現“長紫”輻照后代DNA在不同程度上發生了變異，且基本上與花型和花色的變異類型相關。

傳統的獼猴桃選育種途徑主要有：一是從野生獼猴桃種質中選育，如國內眾多獼猴桃品種；二是從實生后代中選育，如新西蘭的“海沃德”(Hayward)；三是從雜交后代中選育，如武漢植物所選育的“金艷”(A.chinensis×A.eriantha)。上述3個育種途徑中，野生優株選育最快，但難以獲得突破性的品種；雜交育種和實生選種雖然可以獲得好品種，但育種周期長，單果種子數量多，且雄株比例大，難度比其他果樹要大得多。輻射誘變育種是縮短果樹育種周期的有效途徑之一。“長果”獼猴桃(A.longicarpa)是由廣西植物研究所發現的獼猴桃新種，與毛花獼猴桃(A.erianthaBenth.)近緣[18]。具有果皮極易剝離、維生素C含量高、有獨特的芳香氣味等特點[19]，但果實偏小。為改良該品種的不良性狀，葉開玉等[20]用4種劑量的60Co-γ射線輻射處理“長果”獼猴桃的枝條，以篩選適宜輻射劑量。本研究在此基礎上對不同輻射處理后的“長果”獼猴桃樣本進行ISSR分子標記，分析不同處理、不同個體在分子水平上是否存在差異，旨在為獼猴桃誘變育種提供理論基礎，加快獼猴桃育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試“長果”獼猴桃接穗，采自于廣西植物研究所(桂林市)獼猴桃種質圃，20年生嫁接成年樹。于2012年在廣西植物研究所獼猴桃試驗場開展田間試驗，在廣西植物研究所分子生物學綜合實驗室進行分子標記實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 接穗的采集與處理 于樹體休眠期，從長勢中庸的一年生結果枝，選擇處于休眠狀態尚未萌動的中部飽滿芽，每根枝條留8～10個側芽進行剪截。每10條接穗為一捆，用濕毛巾包裹保濕，在低溫冷藏保存備用。

1.2.2 輻射處理 接穗在廣西南翔環保有限公司60Co-γ射線輻照中心進行輻射處理。設5個60Co-γ射線劑量處理：0(CK)、40、60、80和100 Gy；用20 Gy·min-1的劑量率照射。

1.2.3 輻射處理后的嫁接與嫁接后管理 2012年2月25日，在廣西植物研究所實驗場地進行露天嫁接，嫁接砧木為一年生美味獼猴桃實生苗。試驗苗木采用單因素隨機區組排列種植，每個處理設3個重復，每個重復20個接穗，即20株嫁接苗。接穗嫁接萌芽后，及時抹除砧木上原有隱芽萌發后長出的萌蘗，以免與接穗爭奪養分，影響接穗萌發生長。加強栽培后水肥管理，保證嫁接苗的正常生長，并對獼猴桃嫁接萌芽率、成活率和形態變異等進行觀測。

1.3 DNA的提取及PCR反應條件

1.3.1 獼猴桃總DNA提取與制備 以100 Gy輻射處理的長果獼猴桃嫁接苗成活株數為標準，分別從不同輻射處理的成活嫁接苗中隨機選取11株，采集獼猴桃新鮮嫩葉，并對樣品編號(編號取輻射處理的劑量數值和處理樣品數，如選取40 Gy處理的11個接穗，編號依次為40-1，40-2，40-3…)，嫩葉用于提取DNA。DNA的提取，參照李思光[21]、姚春潮等[22]改良CTAB法，并做了適當改進，具體如下：①在液氮中把10 mg新鮮獼猴桃葉片研磨成粉末，研磨同時加入40 mg(6 %，W/V)PVP干粉；②將研磨好的粉末轉入1.5 mL離心管中，加入700 μl預冷的提取介質(0.2 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0；50 mmol·L-1EDTA，pH 8.0；0.25 mol·L-1NaCl)和14 μl β-巰基乙醇，充分混勻后在0 ℃放置10 min。③在4 ℃，7000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。④在沉淀中加入700 μl 65 ℃保溫的2×CTAB(2 % CTAB；100 mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；80 mmol·L-1EDTA；1.4 mmol·L-1NaCl，1 % β-巰基乙醇)提取液充分混勻，置于65 ℃水浴1 h，期間每隔10 min輕輕顛倒混勻1次。⑤冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混勻，在4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。⑥吸取上清液轉入新的1.5 mL 離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混勻，在4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。⑦吸取上清液轉入新的1.5 mL 離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，在-20 ℃靜置2 h后于10 000 r·min-1離心10 min。⑧棄上清液，沉淀用70 %乙醇漂洗2次，晾干后，溶于100 μl TE中，置于-20 ℃下保存備用。

1.3.2 PCR反應條件 引物選用哥倫比亞大學(University of British Columbia，Set No.9，No.801-900)公布的序列，共100條，由上海Sangon公司合成。以“長果”獼猴桃總DNA為模板進行引物篩選，從100條引物中篩選出7條擴增條帶好、信號強且反應穩定的引物(表1)，用于“長果”獼猴桃輻射植株ISSR-PCR分析。

PCR反應體系：采用20 μl的體系進行PCR擴增，其中DNA模板約5 ng，引物0.75 μΜ，2×TaqPCR Master Mix 10 μl，加水補足至20 μl。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，51～53 ℃復性退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環，最后72 ℃再延伸10 min。擴增產物經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(Gel Doc 2000TM)拍照，保存圖像并觀察記錄。

1.4 統計分析

電泳圖譜中一條清晰條帶(DNA片段)，代表一個DNA位點。對DNA條帶進行統計，按照條帶的有或無賦值。在相同遷移位置上有帶(顯性)記為1，無帶(隱性)記為0，依此構成0/1遺傳相似矩陣。僅在重復試驗中能夠穩定出現的DNA條帶用于數據分析。得到的二元數據矩陣用NTSYS 2.1軟件中SM法計算遺傳相似系數，UPGMA法進行聚類分析，構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 不同輻射劑量處理對獼猴桃嫁接萌芽率、成活率和形態變異的影響

接穗嫁接萌芽后，在對接穗的萌芽率、成活率和形態變異等觀察中發現對照的萌芽個數和成活植株數均最多，分別為59、57，成活率達95 %；一年生嫁接苗基部直徑最大，為0.92 cm；死亡植株數最少，死亡率僅5 %；而100 Gy輻射處理后的獼猴桃萌芽個數和成活植株數最少，分別為17、11，成活率僅18.33 %；一年生嫁接苗基部直徑最小，為0.65 cm；死亡植株數最多，死亡率達81.67 %，而形態變異植株比例高達81.81 %(表1)。在100 Gy的輻射劑量范圍內，隨著輻射劑量的增加，死亡植株數相應增加；而萌芽個數、成活植株數、形態變異植株數和一年生嫁接苗基部直徑相應減少，說明輻射處理對“長果”獼猴桃芽的萌發、植株成活率、植株形態變異和一年生嫁接苗基部直徑等均有一定的影響。根據成活植株的外觀形態變異可為確定“長果”獼猴桃適宜輻射劑量為60～80 Gy。

2.2 獼猴桃輻射誘變嫁接植株ISSR引物篩選與多態性分析

利用優化的反應體系，從100條ISSR引物中篩選出擴增條帶清晰、穩定性強的7條引物進行統計分析。用7條引物對55個“長果”獼猴桃總DNA進行PCR擴增，結果如表2所示，共擴增出100個DNA位點，其中約47個為多態性位點，占總位點的46.85 %。其中U820的DNA條帶數和多態位點數最多，分別為17和13，其次是U835和U853，DNA條帶數均為15，多態位點數分別為9、8，U846和U847的DNA條帶數均為14，多態性位點數分別為5、6，U825和U845的DNA條帶數偏少，依次為13、12，多態性位點數依次為1、5。不同劑量輻射處理后多態位點數以60 Gy最多，為46，平均多態位點數為6.6，其次為80和40 Gy，多態位點數分別為34和33，平均多態位點數分別為4.9和4.7，100 Gy處理后多態位點數最少，為30，平均多態位點數為4.3。結合形態變異植株數分析發現，多態位點數與形態變異數相關性不大。

從引物U846的部分PCR擴增結果(圖1)可以看出，60-7，60-8沒有大于1.1 kb的DNA條帶，而80-6和80-7有2條，經輻射誘導的“長果”獼猴桃植株ISSR擴增的帶紋豐富，ISSR反應擴增的條帶分子量一般均為400～1500 bp。

表1 不同輻射劑量處理對獼猴桃嫁接萌芽率、成活率和形態變異的影響

表2 7條ISSR引物序列及擴增結果

Note：Y=(C，T)，R=(A，G).

2.3 聚類分析

利用ISSR-PCR擴增的116條DNA條帶建立遺傳相似矩陣，按UPGMA方法進行聚類分析，構建55個“長果”獼猴桃輻射樣品的聚類圖(圖2)。在遺傳相似系數0.79～1.00的聚類結果顯示，7個ISSR引物能將供試的55個樣品分開。依據遺傳相似性程度，在遺傳相似系數為0.83時，可將55個“長果”獼猴桃植株聚為5類。第Ⅰ類中包含未經輻射處理的CK-1～CK-11，40-1～40-11和60-1～60-5共27個樣品，40-1～40-3與對照的遺傳距離最近，變異程度最小，其次為40-5～40-11和60-1～60-3，60-4和60-5與對照遺傳距離最遠；第Ⅱ類為100-1～100-11和80-11；第Ⅲ類為80-1～80-10和60-9～60-11；第Ⅳ類為40-4單株；60-6～60-8為第Ⅴ類，與對照的遺傳距離最遠，變異程度最大。聚類分析結果表明40、60、80和100 Gy輻射處理后遺傳結構發生變異的株數分別為1、5、11、11，隨著輻射劑量增加，變異植株數也相應增加，這與形態觀察結果一致。聚類分析結果與形態觀察結果比較顯示，100 Gy輻射處理后形態上發生變異株數有9株，而聚類結果顯示11株，說明遺傳結構發生變異不一定從外觀形態上表現出來。

M：100 bp DNA marker；1～5：60-7～60-11；6～14：80-1～80-9圖1 引物U846擴增的部分長果獼猴桃ISSR電泳圖Fig.1 The ISSR electrophoretic figure of partial primer U846‘Changguo’kiwifruit

3 討 論

本研究中，在0～100 Gy的輻射劑量內，隨著輻射劑量的增加，植株存活逐漸減少，變異程度逐漸增大，萌芽個數、成活植株數和一年生嫁接苗基部直徑逐漸減少，這與郭建輝等[12]研究結果一致。Luckey等[23]研究認為，小劑量或適宜劑量輻射對生物體有刺激效應，高劑量射線對植物生長活性酶起抑制作用。80 Gy以上，植株畸形嚴重，主要表現在枝條分化和葉片的性狀上，枝條節間縮短或不分節，葉片表現簇生、失綠發黃、不對稱畸形或皺縮畸形、缺刻等癥狀；這與Luckey等的研究結果基本一致。成活植株的外觀形態變異也可為確定獼猴桃適宜輻射劑量提供依據。結果同時認為，“長果”獼猴桃最佳輻射劑量為60～80 Gy；再次驗證了葉開玉等[21]前期試驗結果，即“長果”獼猴桃半致死劑量為71.7 Gy的結論。可見，60Co-γ射線誘導“長果”獼猴桃發生變異程度具有穩定性。

根據ISSR電泳圖譜分析，與對照相比，60Co-γ射線處理使獼猴桃的遺傳結構發生變異，主要表現為ISSR擴增差異條帶的增加或者減少，可能是基因組中相關位點堿基變化的結果。這也可能是導致植株的形態發生變異的原因。不同引物擴增得到的DNA條帶數不同，條帶數越多，相應的多態性位點數也越多，且多態性位點多分布在較大或是較少DNA片段，而不同劑量輻射處理中以60 Gy多態性位點數最多，60 Gy以上反而略有降低，而形態變異發現100 Gy處理的變異植株比例最多。結合聚類結果分析，40-4、60-6、60-7、60-8幾個單株與對照的遺傳距離最遠，變異程度最大，說明在變異植株中，這幾個單株本身可能特有的突變位點最多，從而也說明了60 Gy多態性位點數較多的原因，而100 Gy處理的變異植株雖然最多，但是多為變異植株共有的。

圖右邊數字代表不同處理樣品編號Number in right figure represented different samples圖2 基于ISSR數據繪制的55份供試材料間的聚類分析Fig.2 The clustering analysis of 55 samples according to ISSR data

4 結 論

本研究結果表明，60Co-γ射線誘變可以造成獼猴桃遺傳結構發生改變。根據輻射處理后的嫁接苗在形態和生長方面等的表型變化情況，在一定程度上可進行輻射遺傳變異的預測和評估。利用ISSR分析方法，可準確測定輻照樣本情況，從中選擇基因變異且性狀良好的突變體作為選育新品種的目標，同時確定適宜的輻射誘變劑量，為輻射誘變育種提供理論基礎和技術支持。

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(責任編輯 溫國泉)

Study on ISSR Molecular Marker of Kiwifruit Mutational Plant Induced by60Co-γ Ray

LIU Ping-ping, YE Kai-yu, GONG Hong-juan, WANG Fa-ming, MO Quan-hui, JIANG Qiao-sheng, LI Jie-wei*

(Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Guangxi Guilin 541006, China)

In order to provide theoretical base for kiwifruit mutation breeding and speed up the breeding process， the variability among irradiation-treated kiwifruit ‘Changguo’ samples were analyzed. The branches of kiwifruit ‘Changguo’ from 55 samples were irradiated by60Co-γ ray in 0 (CK), 40, 60, 80 and 100 Gy, respectively. The polymorphism of these 5 treatments were analyzed using ISSR molecular marker technology. The results showed that 7 screened primers were used for marking from 100 oligonucleotide primers. The average amplified fragment was 14.3, and the polymorphic bands number was 6.7. The polymorphic ratio was 46.85 %. Calculated genetic similarity coefficient was from 0.79 to 1.00. Clustering analysis suggested that the Ⅴclass was 6-8 plants of 60Gy, which the genetic distance was the farthest, and the variation was the largest compared with others. Large genetic variation in kiwifruit was induced by irradiation. It is accurate to measure whether irradiation samples are mutants using ISSR for mutant cultivar.

‘Changguo’ kiwifruit; Radiation; Induction; Variation; ISSR; Mutant

1001-4829(2016)10-2457-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.038

2016-05-07

廣西自然科學基金面上項目(2011GXSFA018092)；廣西科技攻關項目(桂科攻10100006-4A、桂科能14121008-1-14)；國家現代農業產業體系廣西創新團隊建設專項(nycytxgxcxtd-03-13)；廣西植物研究所科學研究基金項目(桂植業12007)

劉平平(1987-)，女，廣西全州人，研究實習員，碩士，主要從事植物病理學研究，E-mail：fhlpp001@126.com,*為通訊作者，E-mail：lijw@gxib.cn。

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