基于生命信息的春灌提高紫花苜蓿抗寒性作用研究

鄔佳賓，苗 澍，焦 瑞，苗恒錄，孫亞楠(. 水利部牧區水利科學研究所， 呼和浩特 0000；. 內蒙古大學， 呼和浩特 000)

農牧業生產中低溫脅迫是影響作物產量和品質的主要非生物脅迫，尤其對于牧草，低溫對牧草越冬期造成的寒害是導致牧草低產的關鍵因素。牧草的抗寒性主要受2個方面因素影響，分別是環境條件與牧草自身性能，前者主要包括水分、溫度和光周期，后者主要是牧草的抗氧化能力、生長時期、發育水平等[1]。紫花苜蓿越冬期低溫造成的凍害是生產上的一大威脅，不僅影響草地的持續高效利用，同時限制了栽培區域的發展。根系的抗寒性是決定紫花苜蓿安全越冬的首要因素之一，冷脅迫下植物可積累更多的可溶性糖、脯氨酸等營養物質，而這些生理指標與植物抗寒性關系密切[2]。研究表明，抗寒性強的紫花苜蓿品種受凍返青前可溶性糖升高而淀粉含量降低，說明苜蓿通過根部淀粉向糖的轉化來提高自身的抗寒能力，因此可將可溶性糖作為評價抗寒能力的依據，游離脯氨酸含量的變化與可溶性糖類似[3]。不同品種紫花苜蓿抗寒能力的強弱同樣表現于可溶性糖、游離脯氨酸含量等相關抗寒生理指標的高低，申曉慧等通過對不同紫花苜蓿品種抗寒生理特性的比較研究，確定了6種紫花苜蓿抗寒能力的大小[4]。即使同一品種苜蓿，由于處理的不同也會表現出抗寒性的差異，陳梓健等以紫花苜蓿“WL525”為試驗材料，采用低溫處理，表明MDA、POD、可溶性糖、相對電導率4個生理指標與該品種紫花苜蓿的抗寒性有密切聯系，紫花苜蓿通過增加POD和可溶性糖的質量濃度來調節低溫對其造成的傷害[5]。

作為一種抗寒性較強的植物品種，當紫花苜蓿受到低溫脅迫時，其滲透調節物質等生命信息都會發生明顯變化，而春灌可以改善苜蓿返青期根區環境，對于緩解低溫脅迫的影響，幫助作物規避低溫脅迫具有作用。早春土地開始解凍后，及時灌水，保持土壤濕潤可以降低土溫，延遲發芽萌動與返青，避免倒春寒危害，并能保證作物返青期的土壤墑情。春灌無疑改善了紫花苜蓿越冬期的環境條件，同時不同春灌條件下紫花苜蓿自身的抗寒性能也發生了變化。實踐證明，通過灌水，增加紫花苜蓿關鍵生育期的土壤含水量能明顯減輕苜蓿凍害程度，提高其越冬率[6,7]。本研究采用苜蓿返青期春灌這一簡單易行的田間管理措施，試驗測定紫花苜蓿返青期的生理生化指標，并結合產量等生命信息，分析和研究春灌條件下紫花苜蓿抗寒性變化，旨在探明春灌改善牧草越冬期低溫脅迫的作用與機理，以期利用春灌改善紫花苜蓿生境條件，提高苜蓿抗寒越冬能力，增加其返青率，實現農牧業水資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2014-2015年在中國水科院牧區水科所草地水土保持生態監測基地進行，行政區歸屬于包頭市達爾罕茂明安聯合旗東南部的希拉穆仁鎮，地理位置為東經111°12′、北緯41°21′，海拔1 600 m。屬大陸性季風氣候，具有冬季漫長嚴寒，夏季短促溫涼，寒暑變化強烈，晝夜溫差大的特點，多年平均降雨量284 mm，且主要集中于7-9月，多年平均蒸發量2 305 mm；年平均氣溫2.5 ℃，多年平均日照時數3 100 h，無霜期83 d，多年平均風速4.5 m/s。

1.2 試驗材料與方案設計

供試苜蓿品種為準格爾，來源于內蒙古自治區草原站。2014年春季完成苜蓿的播種，采用人工條播，行距30 cm，播種量15 kg/hm2，播深3cm，播后鎮壓。

春灌采用滴灌方式，灌溉次數為2次，灌水時間分別選擇于2015年5月6-7日、5月17-18日，同年5月下旬苜蓿返青。灌溉水量分為高(G)、中(Z)、低(D)水量灌溉，另設不灌溉(B)處理。對應灌水量以田持的90%、70%、50%作為灌水上限。苜蓿其余生育期采用一致的田間管理措施，試驗苜蓿為大田種植，每種處理設3個重復，共設置12個試驗小區，每個小區面積為3.0 m×9.0 m，橫向隔離帶寬1.0 m，縱向隔離帶寬0.5 m。

1.3 測定項目及方法

灌溉小區管道出口均設有水表用來讀取春灌水量，并記錄灌水時間。試驗田苜蓿為第2年生，根據當地生產經驗，2015年分別于7月5日、9月20日收獲2茬，對不同處理分別進行測產。

2015年5月20日對不同灌水處理下苜蓿根系進行采樣分析，對其6項生理指標進行測定，做5次重復。其中苜蓿根系滲透調節物質3項，組分及測定方法分別為游離脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法，可溶性糖測定采用苯酚-硫酸法，丙二醛(MDA)測定采用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度計法。測定苜蓿根系保護性酶指標2項，其中超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑法測定，過氧化物歧化酶(POD)采用愈創木酚法測定。采用TTC法測定越冬期苜蓿根系活力作為根系生長指標。

2 結果與分析

2.1 苜蓿根系滲透調節物質測定結果

在低溫脅迫環境下，苜蓿體內積累各種滲透調節物質，使植株具有滲透調節的能力。植物在環境脅迫下，通過細胞內代謝活動，合成某些對原生質無傷害的滲透調節物質從而降低水勢以平衡周圍環境的脅迫。在低溫脅迫下，細胞膜透性增大使細胞內大量物質滲出，此時苜蓿細胞內代謝加強，合成滲透調節物質降低細胞滲透勢從而減輕細胞傷害。

2.1.1游離脯氨酸

脯氨酸含量是一種衡量苜蓿抗寒性的重要生理生化指標。處于低溫等逆境時，植物體內會積累與抗逆性相關的游離脯氨酸。植物體內的游離脯氨酸進行有效的滲透調節作用，維持原生質與環境的滲透平衡，以保持細胞內環境的相對穩定。苜蓿植株體內脯氨酸的含量增加有利于提高其抗寒性[8]，并且隨著低溫脅迫時間的延長，苜蓿體內游離脯氨酸絕對含量逐漸增加[9]。

苜蓿根系游離脯氨酸含量采用茚三酮顯色法在實驗室提取，首先通過實驗制作脯氨酸標準曲線，然后通過測定樣品測定液的吸光度值，結合標準曲線查出樣品測定液中脯氨酸的含量，并最終通過下式計算樣品中脯氨酸的質量分數：

F=(CV)/(aW)

(1)

式中：F是樣品中脯氨酸的質量分數；C是提取液中脯氨酸的質量，μg，由標準曲線求得；V是提取液總體積，mL；a是測定時所吸取的體積，mL；W是樣品重，g。

測定結果詳見表1。

表1 苜蓿根系生理指標測定結果

2.1.2可溶性糖

植物體受低溫脅迫初期，細胞內可溶性糖含量的增加可幫助其適應低溫環境[10]。伴隨環境溫度下降，苜蓿細胞內大分子物質發生水解從而增加可溶性糖，可溶性糖含量越大苜蓿的抗寒能力越強。苜蓿根及根莖中可溶性糖的積累與其抗寒及越冬性呈顯著的正相關[11]。

可溶性糖含量采用苯酚-硫酸法測定，其原理是多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。主要的實驗步驟包括標準品溶液的制備、標準曲線的制作、樣品中可溶性糖的提取和測定。

吸取0.5 mL樣品液于試管中，加蒸餾水0.5 mL，按順序分別加入1 mL的50 g/L苯酚溶液，5 mL濃硫酸，顯色并測定吸光度，有回歸方程求出葡萄糖的量，按照下列公式計算樣品中可溶性糖的含量。

(2)

式中：Ssc是可溶性糖含量，μg/g；C是回歸方程求得的葡萄糖含量，μg；VT是提取液定容體積，mL；V1是吸取樣品液體積，mL；M是稱取樣品的質量，g。

測定結果詳見表1。

2.1.3丙二醛

苜蓿在逆境中受到傷害，伴隨發生膜脂過氧化作用，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是這一作用的最終分解產物，因此越冬期苜蓿根部的MDA含量能夠代表膜脂過氧化的程度，從而間接反映苜蓿抗寒能力的強弱。

采用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法測定，其原理是丙二醛(MDA)與TBA在酸性和高溫條件下反應生成紅棕色的三甲川，并在532nm處有最大光吸收，在600 nm處有最小光吸收。但是糖與TBA顯色反應產物在532 nm處也有吸收(最大吸收峰在450nm處)，測定植物組織中的MDA時會受可溶性糖等多種物質的干擾，因此測定植物組織中MDA-TBA反應物質含量時一定要排除可溶性糖的干擾。已知蔗糖與TBA顯色反應產物在450和532 nm波長下的比吸收系數分別為85.40和7.400；MDA在450 nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數為零，532 nm波長下的比吸收系數為155 000。根據雙組分分光度計法建立方程組如下。

c1=11.71A450

(3)

c2=6.45 (A532-A600)-0.56A560

(4)

式中：c1是可溶性糖的濃度，mmol/L；c2是MDA的濃度，μmol/L；A450、A532、A600分別代表450、532和600 nm波長下的消光度值。

通過上述方程組求得苜蓿根系樣品提取液中可溶性糖、MDA的濃度，根據植物組織的質量計算測定樣品中MDA的質量摩爾濃度：

MMDA=cN/W

(5)

式中：MMDA是MDA質量摩爾濃度，μmol/g；c是MDA體積摩爾濃度，μmol/L；N是提取液體積，mL；W是植物組織鮮重，g。

測定結果詳見表1。

2.2 苜蓿根系保護酶的變化

低溫脅迫下，植物體內超常積累活性氧自由基，引起膜脂過氧化導致冷傷害[12]。而植物體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物歧化酶(POD)等保護酶系統具有清除活性氧自由基的功能，以減輕活性氧對植物的傷害[13]。測定苜蓿根系保護酶的含量，可以反映出其越冬期抵御低溫的能力。

2.2.1超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，簡稱SOD)是植物抗氧化系統的第1道防線，是酶促清除系統的核心酶。逆境中的許多植物，其體內SOD的活性都發生了變化[14]，當然苜蓿也不例外。SOD的高活性避免了活性氧自由基的大量積累，有利于苜蓿細胞膜的穩定，從而提高苜蓿的抗寒性。

超氧化物歧化酶采用氮藍四唑法測定，不同處理下超氧化物歧化酶活性測定結果詳見表1。

2.2.2過氧化物歧化酶

過氧化物歧化酶(POD)采用愈創木酚氧化法測定。測定結果詳見表1。

2.3 苜蓿根系活力的對比

根系是牧草重要的吸收與合成器官，根系的生長狀況及其活力水平直接影響牧草的品質和產量。苜蓿作為宿根牧草，主要依賴根部的活力渡過越冬期，所以，苜蓿根系活力在很大程度上不僅能衡量其生長狀況，更能反映出植株抗寒性的強弱。研究表明，宿根花卉、野牛草、玉簪等植物在低溫脅迫下，根系活力均與植物抗寒性呈顯著的相關關系。可見根系活力是衡量植物抗寒性的重要指標。

研究中采用TTC法測定根系活力。氯化三苯基四氮唑(TTC)是可溶于水的氧化還原物質，但被還原后即生成紅色而不溶于水的TTF，而TTF的還原量能表示脫氫酶活性，并作為根系活力的指標。具體步驟主要包括定性測定和定量測定。定性測定首先確定苜蓿根系樣品有脫氫酶存在；定量測定則包括TTC標準曲線的制作和四氮唑還原強度的計算，四氮唑還原強度可用來表示根系活力。四氮唑還原強度公式如下：

RA=CTTF/(1 000WRH)

(6)

式中：RA是根系活力，mg/(g·h)；CTTF是四氮唑還原量，μg；WR是根重，g；H是時間，h。

測定結果詳見表1。

研究結果顯示，融凍水灌溉條件下，苜蓿根系活力均有不同程度提高，其中以中水量灌溉處理，根系活力增加幅度最大。根系活力的測定結果說明采用融凍水灌溉措施可切實提高苜蓿抗寒性，當以70%田持作為灌水量下限時根系活力獲得了較大幅度的提升。

2.4 苜蓿測產結果

2015年試驗田苜蓿為第2年生苜蓿，根據當地生產經驗收獲2茬，第1茬收獲為2015年7月5日，第2茬收獲為2015年9月20日。對各處理分別進行測產，結果見表2。

表2 不同春灌條件下紫花苜蓿測產結果 kg/hm2

從表2可以看出，不同春灌處理下苜蓿均有一定程度的增產，其原因在于苜蓿返青期良好的土壤墑情提高了苜蓿的成活率，并促進了苜蓿苗期的生長發育。春灌的中灌與高灌兩種處理其最終產量較為接近，而中灌產量略高于高灌產量。

3 討論與結論

3.1 融凍水灌溉條件下苜蓿抗寒性評價

融凍水灌溉后，苜蓿根系生理生化指標發生一系列變化，根據植物生理學理論，指標高低與苜蓿抗寒性密切相關，但是各指標之間具有相互協同作用，采用綜合打分來確定最優灌水量，計分規則為以不灌水處理為對照，每一項指標的變化方向符合植物抗寒性理論即可得分，不符合植物抗寒性理論不得分，按照組分的變化強度由強到弱依次得分3、2、1分。得分表見表3。

表3 苜蓿根系生理指標綜合得分

注：①越高抗寒能力越強；②越低抗寒能力越強。

綜合比較可以看出，中水量灌溉對苜蓿抗寒性的提高效果最好，因此認為融凍水灌水量應以70%田間持水量為宜，實踐中，滴灌模式下，融凍水灌溉以2次為宜。

3.2 基于產量的融凍水優化灌溉模式評價

由測產結果可以看出，春灌條件下苜蓿的產量明顯高于對照處理，筆者認為，春季土壤墑情較差，不利于苜蓿返青和成活率的提高，春灌恰恰能為苜蓿提供良好的生境條件。同時，試驗區5-6月冷空氣活動較為頻繁，苜蓿凍害時有發生，而苜蓿根系抗寒性生理指標的測定結果表明，春灌條件下，苜蓿的抗寒性有較大幅度的增強，有助于苜蓿返青期的生長發育和抵御倒春寒。

3種春灌水量的產量對比可以看出，中水量(70%田持)和高水量(90%田持)春灌條件下產量較高，中水量春灌處理苜蓿產量略高于高水量春灌處理，結合苜蓿抗寒性生理指標得分，初步認為春灌采用中水量灌溉為較優模式。

3.3 結論與展望

春灌條件下，返青期苜蓿根系可溶性糖呈現出隨灌溉水量的增加而增加的趨勢，由于可溶性糖含量越大苜蓿的抗寒能力越強，說明融凍水灌溉增強了苜蓿的抗寒能力。MDA是苜蓿逆境傷害的產物，在融凍水灌溉條件下，返青期苜蓿根系中MDA含量下降，側面反映出融凍水灌溉有助于苜蓿抗寒性的提高。在3種灌水處理下，根系活力均有提升，其中以中水量灌溉處理提升幅度最大，達到169.74%，更直接說明融凍水灌溉提高了苜蓿抗寒性。通過不同灌溉水平的融凍水灌溉試驗，從可溶性糖、丙二醛、根系活力3個方面證明，融凍水灌溉可以顯著提高苜蓿的抗寒性。研究結果表明，低、中、高3種灌溉水量處理中，以中水量灌溉效果最佳。

春灌采用中水量灌溉模式獲得了較高的產量，通過不同數據的綜合比較，初步確認春灌中水量灌溉為是苜蓿春灌的較優灌溉模式。在應用過程中應注意與當地苜蓿生育期相結合，融凍水灌溉不宜過早。

伴隨著我國農牧業產業結構不斷調整和種草畜牧業的迅速發展，紫花苜蓿的種植區域不斷擴大，這些區域地形復雜，氣候多樣，苜蓿越冬除需適應低溫脅迫，還面臨干旱、鹽漬化等多種環境脅迫。要解決苜蓿安全越冬這一問題，就需要對其抗逆機理進行深入研究。多年來隨著對苜蓿抗寒性研究的逐步深入，對其適應低溫脅迫的機理有了一定的認識，但如何保證苜蓿安全越冬才是我們的目的所在。為了減輕凍害，有條件的地區可以通過灌水、覆土、調整種植制度等措施幫助苜蓿安全越冬。改良育種也是保證苜蓿安全生產的一項重要措施，在引進國外優良苜蓿品種的同時，積極培育和改良適合我國地理環境的苜蓿品種。利用傳統育種技術，我國先后于育成了多種耐寒品種，但由于常規育種周期長、成本高，尚不能完全滿足苜蓿生產的需要。近年來分子生物學、生物化學技術不斷發展，為抗寒機理和改良育種提供了有效的技術支撐，盡管基因工程可迅速提高苜蓿的抗寒越冬能力，但是考慮到安全性、穩定性等因素，轉基因苜蓿大多還停留在試驗階段，尚未進入生產應用，同時常規育種與現代育種技術還未有機結合。在未來的研究中應將多層次的方法、技術結合起來，充分關注并切實提高苜蓿的抗寒越冬能力。

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