番茄含氮量快速檢測微電極的研制

左志宇，駱　飛，毛罕平，馬萬征，張曉東，李青林，秦麗娟，呂天遠

(江蘇大學 現代農業裝備與技術教育部重點實驗室，江蘇 鎮江　212013)

?

番茄含氮量快速檢測微電極的研制

左志宇，駱飛，毛罕平，馬萬征，張曉東，李青林，秦麗娟，呂天遠

(江蘇大學 現代農業裝備與技術教育部重點實驗室，江蘇 鎮江212013)

摘要：針對設施栽培番茄營養信息檢測的需求，提出了一種基于多管離子選擇性微電極的番茄含氮量快速檢測方法。為此，詳細討論了多管離子選擇性微電極的拉制、硅烷化、敏感劑充灌和標定等制備過程；通過對現有硝酸根離子和銨根離子敏感劑配方進行試驗分析，篩選出了適用于多管離子選擇性微電極的硝酸根離子和銨根離子敏感膜。通過番茄葉片樣本測試，并與AA3連續流動分析儀測得的含氮量相比，采用多管離子選擇性微電極測得的番茄葉片樣本含氮量絕對誤差為1.03mg/g,相對誤差為3.96%。試驗結果表明：采用多管硝酸根離子和銨根離子選擇性微電極檢測番茄葉片中的含氮量是可行的。該研究可為同時快速檢測作物中鉀、鈣等離子的含量提供參考。

關鍵詞：番茄；含氮量；多管離子選擇性微電極；硝酸根離子；銨根離子

0引言

目前，我國設施園藝發展迅速，設施農業面積已超過380萬hm2，居世界第一位。設施作物生產出產量大、需肥量多、土壤肥力消耗高，且不少溫室、大棚采用無土栽培，容易出現營養元素比例失調或缺素等問題。因此，迫切需要在作物生長過程中對養分信息進行檢測。

傳統的作物營養元素檢測方法主要是通過采集作物樣本在實驗室進行分析，需要破壞性采樣，操作繁瑣、耗時較長、分析結果實時性差，需要專業分析人員操作。離子選擇性微電極進行作物營養檢測，具有快速、準確、簡便等特點，可以進行非破壞活體測量，正逐漸成為國內外作物營養診斷技術的熱點。

20世紀50年代以來，離子選擇性微電極開始被用來研究植物[1]；80年代開始研究將離子選擇性微電極應用到植物營養養分分子，如NH4+[2]、N03-[3-4]、K+[5]等的吸收和再分配過程的研究中。離子選擇性微電極在植物生理學領域中的應用主要包括快速靈敏獲取活體植物營養運輸信息[6-7]，獲得微小區域不同離子微量的信息[8-10]，探測光誘導引起的與葉片生長有關的離子或分子信息[11-13]等。目前，離子選擇性微電極主要檢測單一離子濃度，不能同時檢測多種營養離子的濃度，所以在出現多種營養成分虧缺時，難以判斷作物營養虧缺的真實原因。

針對上述問題，本文提出了一種多管離子選擇性微電極對作物中硝酸根和銨根離子同時進行檢測的方法，并在典型設施栽培作物番茄的含氮量檢測中進行了驗證，實現了番茄含氮量的實時、快速、準確和非破壞活體測量。

1材料與方法

1.1儀器和測試方法

微電極信號放大器使用MultiClamp 700B膜片鉗放大器(AXON公司美國)，工作于I=0模式；數據記錄采用pCLAMP10軟件；微電極夾持和定位采用MP-285微操縱器(SUTTER公司，美國)。

參比電極選用Ag/AgCl電極。硝酸根離子濃度測量電池為：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl和50mM KNO3的混合溶液|硝酸根離子敏感膜‖待測溶液‖Ag+|Ag(+)。

銨根離子濃度測量電池為：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl溶液|銨根離子敏感膜‖待測溶液‖Ag+|Ag(+)。所有測量都在室溫(20～25℃)下的法拉第屏蔽網內進行。

1.2多管離子選擇性微電極的制備

多管離子選擇性微電極的制備包括敏感劑的配制、電極拉制、硅烷化，以及敏感劑、電極內充液的充灌等。

本文設計的多管離子選擇性微電極由粘結在一起的3根軸向平行的微玻璃管組成。微玻璃管經拉制后，在其尖端分別灌充硝酸根、銨根離子敏感劑，然后分別灌入硝酸根離子、銨根離子、參比的內充液，每種內充液中分別插入1根信號線引出信號，用密封膠在微玻璃管的尾部進行密封，如圖1所示。

1. 硝酸根離子敏感劑　2.銨根離子敏感劑　3.多管微玻璃管

1.2.1敏感劑的篩選

對國內外市場上已有的硝酸根離子、銨根離子敏感劑或離子敏感劑配方進行篩選，根據離子選擇性、斜率、響應時間、重現性及穩定性等指標確定最適宜的離子選擇性敏感膜。

從已公開發表的文獻中選擇了5種硝酸根離子敏感劑配方和6種銨根離子敏感劑配方，分別用A1-A5和B1-B5表示。其中，配方A1為Nitrate ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美國)；配方B1為Ammonium ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美國)。配方A2-A5組成如表1所示，配方B2-B6組成如表2所示。

1.2.2電極拉制

采用PMP107型可編程多管拉制儀(PMP-107，美國)的標準3管拉制程序，將1根3管玻璃管(Hilgenberg，德國)拉制成兩根尖端直徑為微米級的多管微電極。

表1　硝酸根敏感劑配方

表2　銨根根敏感劑配方

1.2.3微電極硅烷化

將拉制好的多管微電極置于精密鼓風干燥箱(BPG-9040A，中國)中，150℃下烘烤1h，除去殘存在微電極內的水蒸氣和雜質；將多管微電極放置在帶蓋的玻璃器皿中，放入3mL 5%的二甲基二氯硅烷(國藥集團，上海)，使多管微電極浸泡30min，然后在150℃下繼續烘烤，使二甲基二氯硅烷的蒸氣進入和充分附在微電極的尖端，形成一層疏水層，以利于硝酸根和銨根離子敏感膜的形成和作用。硅烷化后，將去蓋的玻璃器皿在150℃下烘烤，使過量的二甲基二氯硅烷蒸發掉。

1.2.4微電極的充灌

使用微量進樣針將硝酸根離子敏感劑、銨根離子敏感劑從電極尾端緩慢推入微電極尖端;在顯微鏡下觀察微電極內是否有氣泡,若存在氣泡，須將微電極尖端朝下放置一段時間，直至氣泡完全從微電極中消失;然后在微電極管內分別充入相應的硝酸根離子內充液及銨根離子內充液。

1.3電極的標定

標準曲線法是離子選擇性微電極最常用的一種分析方法。將充灌好的多離子選擇性微電極分別放在配制的0.1M、0.01M、1.0mM、0.1mM、0.001mM的硝酸根離子和銨根離子標準溶液中，分別測定其電位，用以評價電極的響應范圍、檢測下限及斜率等性能指標。硝酸根離子標定液的組成參見文獻[18]，銨離子標定液組成參見文獻[16]。

2結果與分析

2.1多管離子選擇性微電極的響應參數

測定了用不同離子敏感劑或離子敏感劑配方制成的離子選擇性微電極，硝酸根離子選擇性微電極在一系列硝酸根離子濃度為0.1M～0.001mM的標定溶液的標定曲線，如圖2所示；響應參數如表3所示。銨根離子選擇性微電極在一系列銨根離子濃度為0.1M～0.001mM的標定溶液的標定曲線，如圖3所示；響應參數如表4所示。

圖2　硝酸根離子選擇性微電極標定曲線

從表3中對比可得，配方A1制成的敏感膜性能優于其它配方。因此，選取配方A1作為本研究的硝酸根離子敏感劑。

表3　硝酸根離子敏感劑在標定溶液中的響應參數

圖3　銨根離子選擇性微電極標定曲線

配方編號響應范圍/M斜率/mV·(log[NH4+])-1檢測下限/M響應時間/sB110-1～10-558.62010-58B210-1～10-451.39310-415B310-1～10-439.94710-450B410-1～10-433.50710-460B510-1～10-428.62310-475

從表4中對比可得，配方B1制成的敏感膜性能優于其它配方。因此，選取配方B1作為本研究的銨根離子敏感劑。

2.2多管離子選擇性微電極的離子選擇性

采用混合溶液法[19-20]測定了多管離子選擇性微電極的選擇性，如表5所示。表5中所有的陰離子均采用鈉鹽，所有的陽離子均采用氯化物。

從表5中可以發現:Br-對NO3-選擇性微電極有一定干擾，但番茄作物中Br-含量較少，其影響可以忽略不計;K+對NH4+選擇性微電極有輕微干擾。

表5　多管離子選擇性微電極的選擇性

2.3多管離子選擇性微電極的穩定性

研制的多管離子選擇性微電極，在室溫下(溫度波動在±2℃內)連續測量10h，當NO3-濃度為10-2M時候，電極電位波動在±1.5mV，相對誤差為1.3%。

2.4多管離子選擇性微電極的重現性

在室溫下(溫度波動±1℃)使用同一支多管離子選擇性微電極對硝酸根、銨根離子濃度均為1mM的被測溶液進行重復測量，每天測試3次，每次連續測量4h，測試結果如表6所示。

表6　微電極的重現性

表6中的標準偏差值較小，說明研制的多管離子選擇性微電極重現性較好。

2.5番茄氮素營養檢測

采用所研制的多管離子選擇性微電極對其設施栽培番茄葉片樣本中NO3-及NH4+濃度進行測試，測得的NO3-和NH4+的離子敏感電極信號穩定后，其電壓值分別為-103.84 mV和-16.53mV，如圖4所示。根據NO3-和NH4+選擇性微電極的標定曲線，計算出番茄葉片內NO3-和NH4+的濃度分別為0.20mmol/L和0.51mmol/L。根據文獻[22]的方法轉換成總氮質量比濃度，得番茄葉片中含氮量為25.00mg/g。

圖4　多管離子選擇性微電極信號記錄圖

采用文獻[20]的方法對番茄葉片樣本的總氮量進行檢測，由AA3連續流動分析儀(SEAL，德國)測得番茄葉片樣本中含氮量為26.03mg/g。

與采用AA3連續流動分析儀測得的含氮量相比，采用多管離子選擇性微電極測得的番茄葉片中含氮量絕對誤差為1.03mg/g,相對誤差為3.96%。

3結論

篩選出的硝酸根離子選擇性微電極和銨根離子選擇性微電極組成的多管離子選擇性微電極，有良好的離子選擇性、重現性和穩定性。與采用AA3連續流動分析儀測量番茄葉片的含氮量相比，采用該方法測量的絕對誤差為1.03mg/g,相對誤差為3.96%。因此，采用該方法制作的多管離子選擇性微電極檢測番茄葉片中的含氮量是可行的。

參考文獻：

[1]Bowling D J F.Measurement of profiles of potassium activity and electrical potential in the intact root[J].Planta, 1972, 108(2): 147-151.

[2]Zhen R G,Koyro H W,Leigh R A, et al.Compartmental nitrate concentrations in barley root cells measured with nitrate-selective microelectrodes and by single-cell sap sampling[J].Planta, 1991,185(3): 356-361.

[3]Meharg A A,Blatt M R. NO3-transport across the plasma membrane of Arabidopsis thaliana root hairs: kinetic control by pH and membrane voltage[J].The Journal of membrane biology,1995,145(1):49-66.

[4]Taylor A R, Bloom A J.Ammonium, nitrate, and proton fluxes along the maize root[J].Plant, Cell & Environment,1998, 21(12):1255-1263.

[5]Miller A J, Smith S J.The mechanism of nitrate transport across the tonoplast of barley root cells[J].Planta, 1992, 187(4):554-557.

[6]賈莉君,范曉榮,尹曉明,等.微電極法測定水稻葉片液泡中硝酸根離子的再調動[J].中國農業科學,2005,38(7):1379-1385.

[7]孟千秋,王磊,王韜,等.用微電極測定生物膜微環境中的物質遷移[J].環境工程,2008,26(5):88-91.

[8]Carden D E, Walker D J,Flowers T J, et al. Single-cell measurements of the contributions of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance[J].Plant Physiology, 2003,131(2):676-683.

[9]尹曉明,范曉榮,賈莉君,等.用微電極測定水稻根系質外體的 pH 值[J].土壤學報, 2006(6):1033-1036.

[10]Hanstein S M, Felle H H.CO2-triggered chloride release from guard cells in intact fava bean leaves. Kinetics of the onset of stomatal closure[J].Plant physiology,2002,130(2):940-950.

[11]Wang J J, Bishop P L.Fabrication, calibration and evaluation of a phosphate ion-selective microelectrode[J].Environmental Pollution,2010,158(12):3612-3617.

[12]Shabala S, Shabala L, Gradmann D, et al.Oscillations in plant membrane transport: model predictions, experimental validation, and physiological implications[J].Journal of experimental botany,2006,57(1):171-184.

[14]賈莉君.離子選擇微電極測定植物細胞跨膜電位和液泡中硝酸根離子濃度的方法研究[D].南京：南京農業大學,2006.

[15]呂文英,章詠華,李文紅.聚氯乙烯 (PVC) 膜硝酸根離子電極的研制[J].分析化學, 1980(1):48-51.

[16]尹曉明,范曉榮,沈其榮.雙阻NH4+選擇性微電極測定水稻葉片細胞中NH4+的活度[J].植物營養與肥料學報,2009,15(3):701-706.

[17]黃西朝,黃強.一次性銨離子 ISFET 的研究[J].分析科學學報,2004,20(1):103-104.

[18]賈莉君,范曉榮,尹曉明,等.雙阻離子選擇性微電極測定活體不結球小白菜葉片細胞中硝酸根離子的活度[J].土壤學報,2005,42(3):447-452.

[19]黃超倫,修榮,劉輝,等.固定干擾法測定ISE選擇性系數實驗方法的改進[J].化學通報,1997(12):55-57，33.

[20]Bakker E.Determination of improved selectivity coefficients of polymer membraneion-selective electrodes by conditioning with a discriminated ion[J].Journal of the Electrochemical Society,1996,143(4):L83-L85.

[21]Wang J.Analytical electrochemistry[M].John Wiley & Sons,2006.

[22]鮑士旦.土壤農化分析[M].北京：中國農業出版社,2000.

Development of Rapid Detection Microelectrode of Tomato Nitrogen Content

Zuo Zhiyu, Luo Fei, Mao Hanping, Ma Wanzheng, Zhang Xiaodong,Li Qinglin, Qin Lijuan, Lv Tianyuan

(Key Laboratory of Modern Agriculture Equipment and Technology, Ministry of Education, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Abstract：To meet the requirement for nutrition information detection of tomato cultivated in protected agriculture, a method for rapid detection of tomato nitrogen content based on multibarrel ion selective microelectrode was proposed. The preparation process of drawn, silanization, sensitive agent filling, and calibration of multibarrel ion selective microelectrode were discussed in detail. Through test and analysis of the present sensitive formulation of NO3-and NH4+, the NO3-and NH4+sensitive membranes which are suitable for multibarrel ion selective microelectrode were screened. In comparison with the nitrogen content detected by AA3 continuous flow analyzer, the absolute error and the relative error for the nitrogen content of the tomato leaf sample are 1.03mg/g and 3.96%, respectively, through the test of tomato leaf sample by multibarrel ion selective microelectrode. The experimental results showed that: it is feasible to detect the nitrogen content of tomato leaf by the multibarrel NO3-ion and NH4+ion selective microelectrode. Besides, this study can provide a reference for detection of the content of potassium and calcium etc. of crops.

Key words：tomato; nitrogen content; multibarrel ion selective microelectrode; NO3-; NH4+

文章編號：1003-188X(2016)03-0174-05

中圖分類號：S641.2;TP212.3

文獻標識碼：A

作者簡介：左志宇(1977-)，男，湖南湘鄉人，副教授，博士研究生，(E-mail)zuozy@ujs.edu.cn。通訊作者：毛罕平(1961-)，男，浙江寧波人，教授，博士，博士生導師，(E-mail) maohp@ujs．edu．cn。

基金項目：國家自然科學基金項目(31201659)；國家自然科學基金重點項目(61233006)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2014BAD08B03)；安徽省科技攻關計劃項目(1301031030)

收稿日期：2015-04-26