烏梅丸方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸上皮細胞凋亡的影響*

閆曙光，惠 毅，李京濤

(1.陜西中醫藥大學，陜西咸陽 712046;2.陜西省胃腸病證方藥重點研究室，陜西咸陽 712046)

烏梅丸方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸上皮細胞凋亡的影響*

閆曙光1，2，惠 毅1，李京濤1

(1.陜西中醫藥大學，陜西咸陽 712046;2.陜西省胃腸病證方藥重點研究室，陜西咸陽 712046)

目的:探討烏梅丸方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸上皮細胞凋亡的影響。方法:SD大鼠用TNBS/乙醇灌腸誘導形成潰瘍性結腸炎，灌胃烏梅丸水煎劑，Q-PCR法檢測各組大鼠結腸上皮組織Fas、FasL表達，ELISA法檢測結腸上皮組織Caspase-3的表達，HE染色觀察大鼠結腸病理組織學變化。結果:與空白組比較，模型組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA表達、Caspase-3含量顯著升高;與模型組比較，烏梅丸大、中、小劑量組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA表達、Caspase-3含量顯著降低;與烏梅丸大劑量組比較，烏梅丸中、小劑量組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA表達、Caspase-3含量顯著升高。結論:烏梅丸可通過抑制結腸上皮細胞的過度凋亡對潰瘍性結腸炎起治療作用，以大劑量組療效最佳。

潰瘍性結腸炎;烏梅丸;細胞凋亡

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是以腹痛、黏液膿血便為主要臨床表現的難治性疾病，病情可反復發作、遷延不愈，是結腸腫瘤的主要誘因之一［1］。病理組織學研究表明，腸黏膜屏障的持續損傷是潰瘍性結腸炎的核心病變［2］。腸黏膜屏障具有腸道保持完整性和抵御外源性微生物侵襲的重要作用，分為物理屏障和化學屏障。結腸上皮細胞既是物理屏障的組成部分，其所分泌黏蛋白、防衛素等多肽抗菌素又構成了化學屏障，由此可見，上皮細胞是結腸黏膜發揮屏障作用的關鍵。進一步的研究表明，結腸黏膜屏障損傷的主要原因是由于結腸上皮細胞的過度凋亡引起的數量減少，其物理屏障和化學屏障功能失常，最終導致潰瘍性結腸炎的發生［3］。因此，抑制結腸上皮細胞的過度凋亡為潰瘍性結腸炎的治療提供了新的思路。烏梅丸是《傷寒論》中治療“久瀉、久利”的經方，為歷代醫家所推崇，治療潰瘍性結腸炎療效確切［4］。藥理研究表明，該方可通過抗炎、止瀉、止痛等途徑對UC發揮治療作用［5］。基于細胞凋亡在潰瘍性結腸炎治療中的作用以及烏梅丸的良好療效，課題組開展了烏梅丸方對UC大鼠結腸上皮細胞凋亡影響的研究，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD雄性大鼠50只，體質量(220 g±20)g，由西安交通大學醫學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(陜)2012-003)，動物飼養于陜西中醫藥大學醫學科研實驗中心。

1.1.2 藥物 烏梅丸方［5］組成:烏梅16 g，人參6 g，當歸4 g，干姜10 g，細辛6 g，桂枝6 g，附子6 g，蜀椒4 g，黃連16 g，黃柏6 g，以上藥物除附子、細辛外均加水浸泡，附子、細辛先煎30 min，余常規煎煮、濃縮后4℃冰箱保存備用。中藥飲片購于陜西興盛德中藥有限公司，經我校中藥教研室鑒定合格。

1.1.3 主要試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸TNBS (批號0002508192)，美國SIGMA公司;RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、Q-PCR SuperMix(批號分別為I20123，H51028，H41129)，北京全式金生物技術有限公司;引物設計與合成(批號見表1)，南京金斯瑞生物科技有限公司;Caspase-3 ELISA檢測試劑盒(批號201407)，武漢伊萊瑞特生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器 NANODROP2000C型核酸測定儀，Thermo(美國)公司;ELX808型酶標儀，美國博騰公司;EDC-810型PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 大鼠稱重后，按隨機數字表法分為空白組、模型組、烏梅丸大、中、小劑量組5組各組10只。除空白組外，余禁食24 h后水合氯醛麻醉，用直徑2.0 mm的硅膠管由肛門輕緩插入約6～8 cm處，將50%的TNBS/乙醇溶液按100 mg ·kg－1劑量緩慢注入結腸，大鼠倒置30 s，誘導潰瘍性結腸炎形成［6］。造模8 h后開始灌胃給藥，給藥劑量參照前期研究結果［7］:烏梅丸小劑量組13.3 g· kg－1，中劑量組 26.6 g·kg－1，大劑量組 53.2 g· kg－1，空白組、模型組均給予生理鹽水10 ml·kg－1，以上各組每日灌胃1次，連續10 d。

1.2.2 結腸組織病理學觀察 取距大鼠肛門6～8 cm間約0.5 cm結腸組織，10%甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片，HE染色觀察結腸病理組織學變化。

1.2.3 結腸上皮細胞Caspase-3的檢測 取距大鼠肛門6～8 cm間0.5 cm結腸段，刮取黏膜制成組織勻漿，ELISA法檢測結腸黏膜Caspase-3的含量，具體實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 結腸上皮細胞織Fas、FasL表達的檢測 表1顯示，取距大鼠肛門6～8 cm間約1 cm結腸段，生理鹽水清洗刮取黏膜層，置于EP管中，加入約1 ml組織裂解液制成組織勻漿，按RNA提取試劑盒所列步驟提取總RNA。取2 μL總RNA按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA，合成后測定cDNA濃度備用。Q-PCR法檢測mRNA表達，PCR采用20 μL反應體系［10］:PCR Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA體積依據濃度添加，加滅菌蒸餾水補足至20 μL;反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s; 57℃退火45 s;72℃延伸40 s;共40～45個循環，72℃終末延伸10 min。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，2組比較采用LSD和SNK法，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR引物序列及批號

2 結果

2.1 烏梅丸方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病理學變化的影響。

圖1顯示，空白組大鼠結腸上皮組織結構完整，界限清晰，結腸黏膜表面光滑，腺體排列整齊有序，未見炎癥細胞浸潤、出血等病理改變。模型組大鼠結腸黏膜大面積缺損，有大量炎性細胞浸潤，腺體排列紊亂甚至萎縮或消失，杯狀細胞數目明顯減少，甚至可見黏膜下層炎癥和出血，為典型的潰瘍性結腸炎病理組織學表現。經給藥治療后，烏梅丸大、中劑量組大鼠結腸黏膜仍可見炎性細胞浸潤，但腺體排烈紊亂明顯減少，黏膜缺損面減小，黏膜下層炎癥和出血明顯減少;烏梅丸小劑量組大鼠仍可見大量炎性細胞浸潤，甚至達黏膜下層，大片黏膜缺損或壞死，表面不平，腺體結構不完整，杯狀細胞數目減少。

圖1 各組大鼠結腸病理組織學觀察(HE染色，×50)

2.2 烏梅丸方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3表達的影響。

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3表達顯著增強(P＜0.01)，表明造模后，結腸上皮細胞Fas和FasL蛋白結合增強，激活下游Caspase-3蛋白，誘發結腸上皮細胞過度凋亡，引起黏膜屏障功能降低，加重黏膜損傷;給藥治療后與模型組比較，烏梅丸大、中、小劑量組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA表達顯著減弱，Caspase-3表達顯著降低(P＜0.01)，表明烏梅丸能有效抑制結腸上皮細胞的過度凋亡，促進黏膜屏障功能和受損黏膜的恢復，對潰瘍性結腸炎發揮了治療作用;各給藥組間比較，大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3的表達差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，其中大劑量組最低，中劑量組次之，小劑量組最高，表明烏梅丸抑制結腸上皮細胞凋亡的作用與劑量成正比關系。

3 討論

細胞凋亡是指在一定的生理或病理條件下，細胞接受刺激信號后的一種自主的、由凋亡相關基因控制的細胞程序性死亡方式，生理狀態下的細胞凋亡有助于維持內環境的穩定，病理狀態下的凋亡則會引起自體損傷［7］。當潰瘍性結腸炎發生時，結腸上皮細胞凋亡增多，在UC炎癥活動區域，正在分化的結腸上皮細胞通過凋亡大量提前死亡導致UC結腸上皮的物理屏障和化學屏障功能破壞，導致結腸黏膜的損傷并最終形成潰瘍面，因此抑制結腸上皮細胞的過度凋亡、修復受損的黏膜組織成為目前潰瘍性結腸炎治療的研究熱點之一［3］。多項研究表明，Caspase-3、Fas和FasL是控制結腸上皮細胞凋亡的主要基因［8］。Caspase-3屬于Caspase超家族成員，是控制細胞凋亡的基因之一，一旦Caspase-3被激活細胞凋亡將會不可逆地進行下去，因此Caspase-3被認為是細胞凋亡的重要標志［9］。Fas是屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的一種跨膜蛋白，它與其配體FasL結合后會啟動凋亡信號并最終引起細胞凋亡。嚴瑾［10］等研究證實，在潰瘍性結腸炎結腸上皮細胞的凋亡過程中，Fas/FasL配體所介導的信號通路發揮了關鍵作用，通過檢測Fas/FasL的表達也許可作為預示UC疾病活動性的重要指標。綜上所述，針對 Caspase-3、Fas/ FasL這條信號通路予以阻斷，為UC的治療提供了新的機制［11］。

表2 各組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA、Caspase-3表達比較(±s)

表2 各組大鼠結腸上皮細胞Fas、FasLmRNA、Caspase-3表達比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與烏梅丸大劑量組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 鼠數 劑量g·kg－1 Fas(mRNA) FasL(mRNA) Caspase-3(ng·ml－1)空 白 組 10 —1.05±0.04 1.06±0.04 1.78±0.05模 型 組 10 — 1.91±0.07＊＊ 1.87±0.08＊＊ 2.24±0.07＊＊烏梅丸大劑量組 10 53.2 1.38±0.04## 1.45±0.02## 1.89±0.05##烏梅丸中劑量組 10 26.6 1.44±0.03##▲ 1.54±0.04##▲ 1.99±0.08##▲烏梅丸小劑量組 10 13.3 1.64±0.04##▲▲ 1.63±0.03##▲▲ 2.12±0.06#▲▲

烏梅丸在《傷寒論》中不僅治療蛔厥，還能治療“久瀉、久利”，后世醫家據此將烏梅丸列入治療痢疾、泄瀉等疾病的方劑中，用于治療下利類疾病。如《千金方》中載其能治“久痢，諸藥不瘥數十年者，消谷下氣，補虛，暴痢，冷痢久下”，《外臺秘要》中用其治療“冷痢久下”，《普濟方》中用治“諸痢久下”，《醫宗金鑒》記載該方治“久痢臟有寒熱不分”。潰瘍性結腸炎是現代醫學病名，屬于中醫學“下利，痢疾”范疇，因潰瘍性結腸炎疾病的發展是一個動態變化的過程，臨床表現中有虛實寒熱等不同，但其發病過程可見由實而虛、由表及里、由輕到重的過程，其病機多為虛實寒熱錯雜。烏梅丸具有清熱燥濕、溫中散寒、補益氣血、收斂固澀的功效，正對潰瘍性結腸炎虛實寒熱錯雜的病機，故臨床療效顯著，但目前缺少該方的相關實驗研究，其具體作用機制尚不十分明確。本次實驗研究表明，烏梅丸方能降低結腸上皮Caspase-3蛋白的表達，降低結腸上皮細胞Fas和FasL mRNA的過度表達，從而抑制結腸上皮細胞的過度凋亡，促進結腸黏膜屏障的修復，對潰瘍性結腸炎發揮治療作用，這可能是該方的作用機制之一。各治療組間比較結果表明，烏梅丸抑制結腸上皮細胞過度凋亡的作用與劑量成正比。烏梅丸是傳統經方，其藥物組成復雜，體現了多種治法的綜合。本次研究只是從細胞凋亡的角度對該方的作用機制進行了初步探索，其具體的作用機制還需更加深入的研究。

［1］Foersch S，Waldner MJ，Neurath MF.Colitis and colorectal cancer［J］.Dig Dis，2012，30(5):469-476.

［2］Seidelin JB，Nielsen OH.Epithelialapoptosis: cause or consequence of ulcerative colitis［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44(12):1429-1434.

［3］李莉，呂春艷，張春艷，等.潰瘍性結腸炎上皮細胞增殖與凋亡觀察分析［J］.中國誤診學雜志，2007，21(7):5000-5001

［4］閆曙光，惠毅，周永學，等.烏梅丸方加減治療潰瘍性結腸炎的療效評價與Meta分析［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2013，19(3):296-298.

［5］閆曙光，惠毅，周永學.烏梅丸及其拆方的鎮痛作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(21):262-265.

［7］Min Zhang，Yin Long，Yang Sun.Evidence for the complementary and synergistic effects of the three-alkaloid combination regimen containing berberine，hypaconitine and skimmianine on the ulcerative colitis rats induced by tri-nitro benzene-sulfonic acid［J］.Eur J Pharmacol，2011，651(3):187-196.

［8］惠毅，閆曙光.烏梅丸拆方對UC大鼠結腸上皮細胞Notch信號通路的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21(7): 114-117.

［9］Buczyński J，Spychalski M，awska-Wierzchniewska A，et al.Higher apoptosis index and proliferation index in colonocytes of patients with ulcerative colitis in remission［J］.Pol Przegl Chir，2012，84(6):271-275.

［9］Jones SA，Butler RN，Sanderson IR，et al.The effect of specific caspase inhibitors on TNF-Alpha and butyrate-induced apoptosis of intestinal epithelial cells［J］.Exp Cell Res，2004，292:29-39.

［10］嚴瑾，歐陽欽，陳代云.潰瘍性結腸炎中Fas/FasL介導的結腸上皮細胞凋亡［J］.中華消化雜志，2001，21(7):397-399.

［11］王志鵬，張蓉，劉莉，等.大黃多糖對潰瘍性結腸炎小鼠結腸上皮細胞和外周血中性粒細胞凋亡的影響［J］.世界華人消化雜志，2006，14(1):29-34.

Effect of Wumei Pill on Apoptosis of Colonic Epithelial Cells in Rats with Ulcerative Colitis

YAN Shu-guang1，2，HUI Yi1，Li Jing-tao1
(1.Shaanxi university of TCM，Shaanxi Xianyang 712046，China;2.Shaanxi gastrointestinal disease and syndrome formulae key laboratory，Shaanxi Xianyang 712046，China)

Objective:To observe the effect of Wumei Pill in colonic epithelial cell apoptosis of ulcerative colitis rats.Methods:Selecting male SD rats and establishing ulcerative colitis model.All the rats except blank group were given Wumei Pill or its Subdivisions，then test the Fas、FasL expressions by Q-PCR method and Caspase-3 expressions in Q-PCR method of rats’colonic tissue.Results:Compared with blank group，Fas，FasL，Caspase-3 expression were statistically significant in model group rats.Compared with model group，there were statistically significant in Wumei Pill high，middle and low groups.Compared with Wumei Pill high groups，there was statistically significant in Wumei Pill middle and low groups.Conclusion:Wumei Pill has therapeutic effect on ulcerative colitis through inhibiting the excessive apoptosis of colon epithelial cells，and the therapeutic effect of Wumei Pill high groups is better than that of middle and low groups.

Ulcerative colitis;Wumei Pill;Cell apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0771-03

2015-12-16

陜西省中醫藥管理局項目(13-jc020)-基于細胞凋亡研究烏梅丸及拆方治療潰瘍性結腸炎的作用機制;陜西省科技廳項目(2013JQ4006)-烏梅丸拆方對UC大鼠結腸上皮細胞和PMN凋亡的影響

閆曙光(1981-)，男，陜西戶縣人，講師，醫學博士，從事中醫藥消化系統疾病的臨床與實驗研究。