電針對圍絕經期抑郁癥大鼠海馬Bcl-2和Bax的影響*

王 戈，任 路，賈連群

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110847)

電針對圍絕經期抑郁癥大鼠海馬Bcl-2和Bax的影響*

王 戈，任 路△，賈連群

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110847)

目的:探討“腎腦相濟”針法對圍絕經期抑郁癥大鼠海馬Bax和Bcl-2的影響。方法:采用去勢和慢性不可預見刺激制備圍絕經期抑郁癥大鼠模型，隨機分為空白組、模型組、藥物組采用鹽酸氯米帕明灌胃，電針組采用電針刺激百會、腎俞、三陰交穴并比較各組大鼠曠場實驗得分，采用酶聯免疫法檢測大鼠海馬Bcl-2和Bax蛋白含量的變化。結果:電針和藥物對圍絕經期抑郁癥模型大鼠都具有較好的治療作用，可明顯提高海馬Bcl-2/Bax比率，抑制海馬神經元細胞凋亡。結論:海馬神經元細胞凋亡與抑郁癥密切相關，電針可通過抑制海馬神經元細胞凋亡起到抗抑郁作用，腎腦相濟對于治療圍絕經期抑郁癥有指導作用。

圍絕經期;抑郁癥;Bcl;Bax

圍絕經期是女性由生殖功能旺盛狀態向老年衰退的過渡時期?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩?“女子七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通?！薄疤旃锝摺贝砼孕韵佥S衰退，生殖機能喪失［1］。臨床研究發現，女性在性激素迅速變化的時期對抑郁的易感性增高，激素變化和心理社會因素使圍絕經期成為女性抑郁癥的高發時期之一，圍絕經期抑郁癥的發病率占23.8%［2］。近年研究發現，圍絕經期抑郁癥發病率有逐年增高趨勢。電針對抑郁癥有較好的療效，本實驗復制圍絕經期抑郁癥大鼠動物模型，采用“腎腦相濟”電針療法，觀察大鼠行為和海馬Bcl-2和Bax蛋白含量的變化，期望從海馬神經元凋亡這一角度探討電針對圍絕經期抑郁癥的治療機理。

1 材料

1.1 動物與分組

17周齡SPF級雌性SD大鼠40只，體質量(240 ±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK(京)2012-0001)提供。按隨機數字表法分為空白組、模型組、藥物組和電針組各10只。

1.2 藥物與試劑

鹽酸氯米帕明片25 mg/片(江蘇恩華藥業股份有限公司生產);酶聯免疫試劑盒(ameko，購于上海嵐派生物科技有限公司)。

1.3 實驗儀器

成都泰盟軟件有限公司OFT-100大小鼠開場活動實驗系統;蘇州醫療用品廠“華佗牌”針灸針(0.25×25 mm);汕頭市醫用設備廠有限公司805-AⅡ型電針儀。

2 方法

2.1 造模方法

圍絕經期模型一般選用自然衰老大鼠，其生長周期長，飼養成本高，來源稀少，相關的研究報道相對較少［3］。去勢是公認的圍絕經期造模方法，去勢大鼠陰道脫落細胞變化和血清性激素水平與自然圍絕經期發生的改變相似［4-5］。本實驗除空白組外，其余大鼠全部接受雙側卵巢摘除術。術后休養1周，之后連續5 d對全部大鼠采集陰道脫落細胞涂片，除空白組外其余各組大鼠涂片無周期性變化，說明圍絕經期模型造模成功。之后全部大鼠接受慢性不可預見性刺激(UCMS)［6］，刺激持續21 d，包括夾尾(用止血鉗夾住距大鼠尾尖1 cm處1 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、熱應激(45℃，5 min)、禁食禁水(24 h)、束縛限制行動(1 h)、潮濕墊料并傾斜鼠籠(24 h)和晝夜顛倒(24 h)等7種刺激，每種刺激隨機出現，相鄰2 d不能給予同樣刺激，每種刺激在21 d中出現不少于3次。

2.2 治療方法

在21 d的造模結束后，空白組和模型組大鼠正常飼養，藥物組使用鹽酸氯米帕明灌胃。鹽酸氯米帕明是一種三環類抗抑郁藥，是動物實驗中常用的陽性對照藥物，臨床使用有良好的抗抑郁效果。實驗中將藥片碾碎后溶于0.9%生理鹽水中，按20 mg/kg·d-1用量灌胃，每日1次，連續灌胃28 d;電針組根據《實驗針灸學》大鼠穴位定位方法，取“百會”、“腎俞”和“三陰交”穴。施針后連接電針儀，選用疏密波，頻率2 Hz，通電量以穴位皮膚肌肉輕微抽動為準，留針20 min。電針治療每天1次，連續治療28 d。

2.3 觀察指標與取材方法

2.3.1 曠場實驗 曠場實驗(Open-Field Test)是測定抑郁癥大鼠行為學的經典方法［7］，能反映大鼠在新奇環境中的活動度、探究行為、恐懼緊張狀態及警覺性。本實驗采用OFT-100大小鼠開場活動實驗系統，記錄大鼠在3min內總的移動距離和在中心區域停留的時間。在相同時間內，大鼠移動的總距離反映大鼠活躍程度，曠場中心區域停留的時間反映大鼠對于陌生環境的好奇程度。每只大鼠完成后清理曠場黑箱，避免對下只大鼠造成影響。上午8∶00-11∶00選在安靜室內進行，造模開始前1 d、造模結束后1 d和治療結束后1 d，共測定3次。

2.3.2 Bcl-2和Bax蛋白含量測定 實驗過程中大鼠共死亡6只，模型組在冰水游泳和熱應激中各死亡1只，電針組在冰水游泳和禁食禁水中各死亡1只，西藥組在冰水游泳和灌胃中各死亡1只。

第3次曠場實驗完成后，剩余34只大鼠用10%水合氯醛麻醉，剝離大鼠腹主動脈使其失血死亡后，剪開顱骨冰盒上取腦，分離海馬勻漿，3000 r/ min離心10 min，吸取上清液，－80℃冰箱保存備用。酶聯免疫吸附法(Elisa法)檢測海馬組織中Bcl-2和Bax含量，試劑的配制和檢測操作按照試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 曠場實驗結果

表1顯示，去勢手術后慢性不可預見刺激(UCMS)造模前，各組大鼠之間總移動距離的差異無統計學意義(P＞0.05);造模后模型組大鼠的總移動距離明顯低于空白組，差異有統計學意義(P＜0.05)。經過28 d治療后，電針組和藥物組高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05);去勢手術后UCMS造模前，各組大鼠中心區域停留時間差異無統計學意義(P＞0.05);造模后，模型組時間明顯低于空白組，差異有統計學意義(P＜0.05);經過28 d治療后，藥物組和電針組高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠曠場實驗總移動距離和中心區域停留時間結果比較(±s)

表1 各組大鼠曠場實驗總移動距離和中心區域停留時間結果比較(±s)

注:與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組 別 鼠數 造模前 造模后 治療后移動距離 停留時間 移動距離 停留時間 移動距離 停留時間空白組 10 4476.20±522.34 8.01±1.41 4193.46±723.738.44±1.58 4521.27±203.15 8.42±1.48模型組 8 4549.28±604.20 7.91±1.89 1352.30±606.241) 4.05±1.031) 1101.22±365.61 4.12±1.18藥物組 8 4446.49±491.36 8.08±1.84 1310.13±411.34 3.96±1.29 3456.18±588.632) 7.52±1.102)電針組 8 4443.62±533.94 8.03±1.72 1278.70±287.98 3.91±1.05 3852.00±405.742) 7.68±0.482)

3.2 海馬中Bcl-2、Bax蛋白含量變化

表2顯示，經過28 d治療后，模型組Bcl-2含量低于空白組，Bax含量高于空白組，Bcl-2/Bax比值低于空白組，差異有統計學意義(P＜0.05);電針組Bcl-2含量高于模型組，Bax含量低于模型組，Bcl-2/Bax比值高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05)。電針組Bcl-2/Bax比值高于藥物組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠海馬中Bcl-2和Bax蛋白含量的比較(±s)

表2 各組大鼠海馬中Bcl-2和Bax蛋白含量的比較(±s)

注:與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與藥物組比較:3)P＜0.05

組 別 鼠數Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax空白組10 50.06±0.68 37.84±0.86 1.32±0.04模型組 8 23.14±0.711) 59.83±0.831) 0.39±0.021)藥物組 8 42.83±0.91 52.76±1.19 0.81±0.03電針組 8 45.28±1.372) 46.41±1.322) 0.98±0.022)3)

4 討論

腦為“元神之府”，抑郁癥等情志疾病的發病和腦的功能異常有關?！鹅`樞·海論》曰:“腦為髓之?！保X主精神意識思維活動功能的物質基礎是腦髓。《素問·陰陽應象大論》曰:“腎主骨生髓。”腎精不足則腦髓不滿，腦的形態、功能失常。圍絕經期婦女天癸竭，腎精不足、髓海空虛，導致腦的精神意識功能失常，出現圍絕經期抑郁癥等癥狀［8］。又由于腎病及腦、腦病及腎，所以腦腎失濟是導致該病的關鍵。腎俞、三陰交、百會三穴相合起到補腎益腦、安神解郁的作用。

現代醫學研究表明，腦內神經元是中醫所言腦髓的現代生物學基礎之一［9］;腦內神經元細胞萎縮和凋亡造成“髓海不足”［10］。海馬是與情感疾病相關的大腦邊緣系統構成組織之一，在學習、記憶、情緒、內分泌及內臟活動中起重要作用，也是介導應激反應的重要腦區。有研究發現，抑郁癥患者存在海馬損害，并與海馬神經細胞凋亡增加有關［11］。故抑制海馬神經元凋亡，促進海馬細胞增殖已成為抑郁癥的治療目標之一［12］。Bcl-2蛋白家族是膜的整合蛋白，根據功能和結構可分為兩類，一類抑制凋亡，如Bcl-2、Bc1-xL、Bcl-w;一類促進凋亡，如Bax、Bak、Bad、Bid。Bcl-2基因及其表達蛋白可抑制多種組織細胞的凋亡［13］，能抑制凋亡蛋白活性［14］，對神經元具有類似神經營養因子的保護作用［15］。有研究表明，束縛應激大鼠的海馬神經元Bcl-2表達下調，Bax表達上調［16］。某些抗抑郁藥物可以通過抑制海馬組織Bax mRNA的表達和促進Bcl-2 mRNA表達，進而減少海馬神經元細胞凋亡，達到治療抑郁癥的作用［17］。Bcl-2/Bax的比例關系是決定抑制細胞凋亡作用強弱的關鍵［18］。

本實驗采用去勢造模方法，人為造成雌激素驟然下降模擬圍絕經期綜合征的狀態，該方法周期短、簡單易行，是公認的一種圍絕經期綜合征造模方法［5］。經過28 d慢性不可預見性刺激后，大鼠行為學檢測改變、探索能力較差，可判定處于焦慮抑郁狀態。結果表明，模型組大鼠海馬中Bcl-2表達下降，Bax表達上升，Bcl-2/Bax比例下降，說明慢性不可預見刺激會造成大鼠海馬細胞凋亡增多，進而導致抑郁狀態的產生。經過電針和藥物治療之后，Bcl-2表達上升，Bax表達下降，Bcl-2/Bax比例升高，說明兩者都有抑制海馬細胞凋亡的作用，且電針的效果要強于鹽酸氯米帕明。這可能是電針治療抑郁癥的作用機制之一。

本次實驗研究證明，海馬神經元細胞凋亡與抑郁癥密切相關，電針可通過抑制海馬神經元細胞凋亡起到抗抑郁作用，電針及藥物均可以改善大鼠抑郁狀態。但鹽酸氯米帕明起效慢(往往需要2周以上)，并伴隨諸多不良反應，病人依從性較差。而電針與鹽酸氯米帕明療效相當，可以發揮其簡便廉特點，適合臨床推廣應用，尤其“腎腦相濟”理論指導下的電針療法對于治療圍絕經期抑郁癥具有指導作用。

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R245.9+7

A

1006-3250(2016)06-0838-03

2015-10-07

國家自然科學基金面上項目(81373718)-基于“腎腦相濟”理論探討電針誘導腦海馬內源性神經干細胞分化治療圍絕經期抑郁癥的作用;中醫“腎精命火”臟象理論相關疾病與證候的研究(2010CB530401973)

王 戈(1988-)，男，山東青島人，在讀博士，從事針刺機理的現代研究。

△通訊作者:任 路(1966-)，女，四川巴縣人，教授，博士研究生導師，國家局學科帶頭人，從事針灸情志病的臨床與研究，E-mail:renlu2008.student@sina.com。