β-arrestin2在內毒素誘導的肝臟損傷中的作用

蔣夢萍　禤婕瀅　徐春　羅千江　尉秀清

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院消化內科

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β-arrestin2在內毒素誘導的肝臟損傷中的作用

蔣夢萍禤婕瀅徐春羅千江尉秀清

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院消化內科

【摘要】目的探討β-arrestin2在內毒素誘導的肝臟損傷中的作用機制。方法建立內毒素誘導的肝臟損傷模型，將β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窩β-arrestin2野生型(WT)小鼠20只分別隨機分成實驗組及對照組(n=10)，實驗組腹腔內注射脂多糖(5 mg/kg)，而對照組注射等量生理鹽水，6 h后留小鼠血清和肝臟組織標本。實時定量PCR檢測小鼠體內 β-arrestin2表達量，ELISA檢測各組小鼠血清中ALT、AST及TNF-α水平，蛋白免疫印跡法檢測各組β-arrestin2、p-p65及p-IкBα蛋白的表達。結果β-arrestin2 WT 實驗組肝臟組織中 β-arrestin2 mRNA為0.18±0.06，明顯低于正常對照組的1.00±0.29(t=-4.669，P<0.001)，β-arrestin2蛋白表達也明顯低于WT對照組；β-arrestin2 KO實驗組血清ALT為(204.33±22.33) U/L、AST為(403.40±53.45) U/L，明顯高于β-arrestin2 WT實驗組ALT的(129.33±9.69)U/L和AST(256.20±40.47) U/L(t=7.55、6.94，P均<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組血清TNF-α為(155.89±14.89)pg/L，明顯高于WT實驗組的(101.36±10.65)pg/L(t=9.25，P<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組肝臟組織中p-IкBα及p-p65的蛋白表達量明顯高于β-arrestin2 WT實驗組。結論β-arrestin2可能通過抑制NF-κB活化、減少TNT-α釋放從而減輕內毒素誘導的炎癥反應，在內毒素誘導的肝臟損傷中起保護作用。

【關鍵詞】內毒素誘導的肝臟損傷；β-arrestin2；TLR4/NF-кB/TNF-α信號通路

內毒素本質是革蘭陰性細菌細胞壁上的脂多糖，當細菌裂解或其黏附在其他細胞上時脂多糖可釋放出來。脂多糖是機體內誘發炎癥反應的主要致病成分。肝臟既是清除內毒素的場所，也是內毒素血癥過程中最易受損的器官之一。內毒素誘導的肝臟損傷是多種肝病的主要病理基礎[1-2]。現有的大量研究表明，肝臟枯否細胞內激活多種信號通路誘發的炎癥反應是內毒素誘導的肝臟損傷的關鍵機制[3]。β-arrestin2是Arrestins家族中成員之一，廣泛表達于哺乳動物的各種組織細胞中，尤其是免疫系統；β-arrestin2可作為負調控因子介導受體脫敏和內吞[4]。除此之外，β-arrestin2可作為“鷹架”蛋白，參與多種信號通路[5-6]。本研究旨在觀察β-arrestin2在內毒素誘導的肝臟損傷中的生物學作用，并探討其可能的作用機制。

材料與方法

一、 實驗動物

C57BL/6J背景的β-arrestin2+/-雌雄配對小鼠由美國杜克大學醫學中心Robert J.Lefkowitz教授饋贈，在中山大學附屬第三醫院疫苗研究所動物中心按SPF級培育，該動物實驗獲得該院醫學倫理委員會批準。

二、 實驗試劑和儀器

1.主要實驗試劑及抗體

脂多糖(Sigma，US)，ALT試劑盒(Cusabio，武漢)，AST試劑盒(Cusabio，武漢)，TNF-α ELISA試劑盒(Cusabio，武漢)，蛋白質定量試劑盒(Genstar，北京)，組織RNA提取試劑盒(Magen，北京)，qPCR逆轉錄試劑盒(TOYOBO，上海)，30%丙烯酰胺(BIO-RAD, US)，過硫酸鈉(BIO-RAD，US)，TEMED(BIO-RAD，US)，β-arrestin2抗體(美國杜克大學醫學中心Robert J.Lefkowitz教授饋贈)，p-p65抗體(Cell Signaling Technology，US)，p65(Santa Cruz，US)，p-IкBα(Santa Cruz, US)，IкBα(Santa Cruz, US)，GAPDH(Santa Cruz，US)等。

2.主要儀器

低溫高速冷凍離心機(Eppendorf公司，Germany)，SDS-PAGE電泳槽(BIO-RAD，US)，轉膜儀(BIO-RAD，US)，PCR儀(Labnet，US)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific，US)等。

三、實驗方法

1.內毒素誘導的肝臟損傷模型建立

選取6～8周齡(22～25 g)的雄性β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窩來源的β-arrestin2野生型(WT)雄性小鼠20只，分別將它們隨機分成實驗組和對照組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射5 mg/kg脂多糖，對照組小鼠注射等量的生理鹽水。

2.標本采集與處理

6 h后，10%水合氯醛麻醉后行開腹手術，腹腔下靜脈取血，迅速取肝臟組織，將部分肝臟組織放入10%中性福爾馬林中固定制作石蠟標本，剩余部分保存于液氮中，待提取蛋白質或RNA；血漿在室溫靜置1 h后離心留血清保存于-80℃。

3.ELISA檢測ALT、AST及TNF-α水平

根據各試劑盒說明書，檢測各組血清中ALT、AST及TNF-α水平。

4.肝臟組織RNA提取及逆轉錄

取適量肝臟組織，按組織RNA提取試劑盒說明書進行提取RNA，并用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，再根據qPCR逆轉錄試劑盒合成cDNA。

5.肝臟組織蛋白提取及蛋白質電泳

取適量肝臟組織，按蛋白質提取裂解液說明書提取組織總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。分裝蛋白并進行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉膜(PVDF膜)、封閉后，用相應目的蛋白的抗體孵育，4℃冰箱搖床過夜，其中對總蛋白分別用抗β-arrestin2、p-p65、p65、p-IкBα、IкBα的一抗孵育。次日復溫30 min后，HRP標記的二抗孵育2 h，暗房曝光。

四、統計學處理

結果

一、 β-arrestin2 WT小鼠在腹腔注射脂多糖后實驗組與對照組肝臟組織中β-arrestin2水平比較

腹腔注射脂多糖 6 h后觀察，實驗組小鼠均活動減弱，體毛寒立，蜷曲姿勢，眼睛可見膿性分泌物，解剖時見肝臟腫脹較對照組略大。通過提取肝臟組織RNA，再檢測β-arrestin2的表達量，實驗發現β-arrestin2 WT小鼠腹腔注射脂多糖后肝臟組織中β-arrestin2 mRNA表達量0.18±0.06，對照組1.00±0.29，實驗組比對照組低，此差異有統計學意義(t=-4.669，P<0.001，圖1A)。進一步提取肝臟組織蛋白，通過蛋白免疫印跡法檢測，發現小鼠在腹腔注射脂多糖后肝臟組織中β-arrestin2蛋白水平也明顯下降(圖1B)。

圖1　β-arrestin2 WT小鼠注射脂多糖6 h后肝臟組織中β-arrestin2水平變化

A：β-arrestin2 WT實驗組與對照組肝臟β-arrestin2 mRNA水平比較,*P<0.05；B：蛋白免疫印跡電泳圖β-arrestin2 KO小鼠注射脂多糖后肝臟損傷加重

β-arrestin2 KO實驗組的ALT、AST高于β-arrestin2 WT實驗組，差異均有統計學意義(t=7.55，P<0.001；t=6.94，P<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組血清TNF-α為(155.89±14.89)pg/L，而其β-arrestin2 WT實驗組血清中TNF-α為(101.36±10.65)pg/L，前者分泌更多TNF-α(t=9.25，P<0.001)，見表1。

表1　各組小鼠肝臟損傷情況比較

注：與β-arrestin2 KO對照組比較，aP<0.01；與β-arrestin2 WT實驗組比較，bP<0.01；與β-arrestin2 WT對照組比較，cP<0.01

二、 β-arrestin2 WT組和KO組注射脂多糖6 h后肝臟損傷指標比較

比較β-arrestin2 WT實驗組與β-arrestin2 KO實驗組的肝臟組織中p-IкBα及p-p65蛋白的表達量，我們發現β-arrestin2 KO實驗組高于β-arrestin2 WT 實驗組(圖2)。

討論

有關肝臟損傷的研究仍是生物學領域的研究熱點之一，而其中內毒素誘導的肝臟損傷是許多其他肝臟疾病的主要病理基礎。大量研究表明，肝臟枯否細胞是肝臟內產生炎癥遞質的主要來源，它是機體防御內源性、外源性感染的重要效應細胞。脂多糖的受體是Toll樣受體4(TLR4)，它在枯否細胞的細胞膜上大量表達，當脂多糖與其受體TLR4結合后可引發枯否細胞內一系列的信號通路激活從而誘導炎癥反應[7]。激活后的枯否細胞可釋放多種炎癥介質，間接作用于肝細胞從而引起肝細胞的壞死、凋亡和損傷[8]。其中，TLR4/NF-кB 信號通路激活是內毒素誘導的肝臟損傷的重要機制之一，TNF-α一方面誘導中性粒細胞在肝內聚集，另一方面又可誘導激活肝內凝血系統，進一步加重肝臟損傷。

圖2　β-arrestin2 WT實驗組與β-arrestin2 KO實驗組肝臟組織中p-IкBα及p-p65蛋白表達水平比較

β-arrestin2最早被發現是作為G蛋白偶聯受體信號通路的重要負性調節因子，可介導細胞膜表面多種受體的脫敏和內吞作用。實際上，β-arrestin2是一種多功能“鷹架”蛋白。有研究發現β-arrestin2可以與IкBα 結合進一步干擾IкBα的磷酸化、降解和抑制NF-кB活化。另外有研究指出，在脂多糖或IL-1β刺激下，β-arrestins能直接結合腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)而阻止后者的寡聚化和泛素化。TRAF6和IкBα都是TLR4/NF-кB 信號通路中重要的信號分子；我們以此推測β-arrestin2可以負性調控TLR4/NF-кB 信號通路。在本實驗中，我們的結果顯示β-arrestin2 WT小鼠在腹腔內注射脂多糖(5 mg/kg)6 h后，肝臟組織β-arrestin 2 mRNA和蛋白表達均明顯下降；接著我們發現β-arrestin2 KO實驗組的炎癥因子表達量高于β-arrestin2 WT實驗組，而且前者的血清ALT、AST和TNF-α含量都高于后者，這說明了β-arrestin2 KO實驗組的肝臟損傷情況比β-arrestin2 WT實驗組的嚴重。β-arrestin2在內毒素誘導的肝臟損傷中起保護作用，在肝臟損傷過程，β-arrestin2表達受到抑制，進而內毒素引起的炎癥反應更加強烈。同時，我們的結果分析提示了β-arrestin2起保護作用的機制可能與抑制NF-кB 磷酸化和核內移、減少TNF-α釋放有關。

綜上所述，β-arrestin2在內毒素誘導的肝臟損傷中起保護作用，其機制可能是抑制了NF-кB活化，減少促炎因子TNF-α釋放，進而抑制內毒素誘導的炎癥反應放大，但具體的分子機制尚需進一步深入研究。

參考文獻

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(本文編輯：楊江瑜)

Effect of β-arrestin2 in endotoxin-induced liver injury

JiangMengping,XuanJieying,XuChun,LuoQianjiang,WeiXiuqing.

DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of the function of β-arrestin2 in the endotoxin-induced liver injury. MethodsEndotoxin-induced liver injury mouse models were established. Twenty β-arrestin2 knockout (KO) mice and twenty β-arrestin2 wild-type (WT) littermates were randomly divided into the experimental and control groups(n=10). In the experimental group, liver injury was induced by intraperitoneal injection of 5 mg/kg of lipopolysaccharide, and the control mice were administered with an equivalent quantity of normal saline. Six hours later, serum sampling and liver tissue were collected. The expression of β-arrestin2 in the mouse liver was measured by quantitative real-time PCR. The serum levels of ALT, AST and TNF-α were detected by ELISA. The expression of β-arrestin2, p-p65 and p-IкBα proteins was determined by Western blot. ResultsThe expression level of β-arrestin2 mRNA in the β-arrestin2 WT group was 0.18±0.06, significantly lower than 1.00±0.29 in the control group (t=-4.669, P<0.001). The expression of β-arrestin2 protein was also obviously down-regulated. In the β-arrestin2 KO group, the values of ALT and AST were (204.33±22.33)U/L and (403.40±53.45)U/L, significantly higher compared with (129.33±9.69)U/L and (256.20±40.47) in the β-arrestin2 WT group (t=7.55, P<0.001; t=6.94, P<0.001). The serum level of TNF-α in the β-arrestin2 KO group was (155.89±14.89) pg/L, significantly higher than (101.36±10.65) pg/L in the β-arrestin2 WT group (t=9.25，P<0.001). In the β-arrestin2 KO group, the expression of p-IкBα and p-p65 proteins within the mouse liver was significantly higher compared with that in the β-arrestin2 WT group. Conclusionβ-arrestin2 alleviates endotoxin-induced inflammatory response probably inhibiting the activation of NF-кB and reducing the production of TNF-α, which plays a protective role in endotoxin-induced liver injury.

【Key words】Endotoxin-induced liver injury; β-arrestin2; TLR4/NF-кB/TNF-α signaling pathway

(收稿日期：2015-11-06)

Corresponding author, Wei Xiuqing, E-mail: wei-xiuqing@163.com

通訊作者，尉秀清，E-mail: wei-xiuqing@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目(81470848)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.005

·基礎研究論著·