分子遺傳學檢查診斷Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型3例*

史萍，沈鑒東，劉瑤，邵宇云，嚴友德，金柯，劉源，李軍，蔣龍鳳

·遺傳性肝病·

分子遺傳學檢查診斷Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型3例*

史萍，沈鑒東，劉瑤，邵宇云，嚴友德，金柯，劉源，李軍，蔣龍鳳

目的探討采用分子遺傳學檢查診斷Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型的方法。方法在本科收治的3例高間接膽紅素血癥患者，抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，應用PCR法擴增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1基因（UGT1A1）所含5個外顯子及其側翼序列，進行DNA直接測序。結果3例患者均檢出UGT1A1基因5號外顯子存在c.1456 T＞G（p.Y486D）純合突變；Y486D位于第5外顯子上，使1456位胸腺嘧啶（T）突變為鳥嘌呤（G），導致486位氨基酸由酪氨酸（Tyr）變為天冬氨酸（Asp）。結論當臨床上高度懷疑Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型時，應盡早行分子遺傳學檢查，確定其基因突變位點，以明確診斷。

Crigler-Najjar綜合征；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶；基因突變

Crigler-Najjar綜合征（CNS）屬于遺傳性非溶血性高間接膽紅素血癥[1]，分為Ⅰ型和Ⅱ型。CN-Ⅰ型由Crigler和Najjar在1952年首次報道[2]，患者尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）活性完全缺乏，血清膽紅素水平可高達340～850μmol/L[3]，常死于膽紅素腦病，或遺留有嚴重的神經系統后遺癥。CN-Ⅱ型患者UGT活性部分缺乏，血清膽紅素水平為85～340μmol/L，可被苯巴比妥誘導，終生使用苯巴比妥治療可長期生存。已有研究證實，編碼UGT的GUT1A1基因是CNS的遺傳學基礎[4]，進行UGT1A1基因檢測以及結合臨床診斷已成為目前診斷CNS的主要方法。本文報道3例黃疸待查患者，結合實驗室、肝臟穿刺組織病理學和分子遺傳學檢查診斷的CN-Ⅱ型患者，以供臨床醫生學習、借鑒。

1 資料與方法

1.1 病史特點2013年8～11月我科收治的3例男性患者，診斷時年齡分別為15歲、23歲和29歲。臨床均有反復皮膚、眼黃，尿黃，乏力癥狀，皮膚黃染可于勞累后出現，病程分別為4年、3月和20年。前2例患者血清總膽紅素（TBIL）分別為109.6 μmol/L和193.5μmol/L，間接膽紅素（IBIL）分別為92.3μmol/L和185.4μmol/L，其余生化指標如丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷氨酰基轉肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）等均無異常。血常規、病毒性肝炎相關標志物、銅藍蛋白、眼底檢查、肝膽胰脾B超等檢查無異常發現，無特殊用藥史，無遺傳性疾病家族史。第3例患者血清TBIL 266.6μmol/L，IBIL200.6μmol/L，ALT 734 U/L，AST 204 U/L，GGT 1180 U/L，外院肝膽胰脾B超檢查提示膽囊壁粗糙，輕度脂肪肝，其余輔助檢查無明顯異常。予以保肝等治療后轉氨酶降至正常，但膽紅素下降不明顯。

1.2 肝活檢第2和第3例患者進行了在B超引導下肝臟穿刺術檢查。

1.3 UGT1A1基因檢查患者及其父母簽署知情同意書后，分別抽取外周靜脈血2 m l，采用商品化基因組DNA提取試劑盒（天根，北京）抽提樣本基因組DNA。采用Primer Premier 5.0設計UGT1A1基因外顯子編碼區及其側翼序列擴增引物（表1），提交上海生工公司合成。采用Sanger法對PCR擴增產物測序，將測序結果與UGT1A1基因參比序列（NM-000463）進行比對分析。

表1 UGT1A1基因外顯子編碼區及其側翼序列擴增引物

2 結果

2.1 臨床特征分析本組3例患者血清TBIL在109.6～266.6μmol/L之間，以間接膽紅素升高為主，予以護肝藥物治療后，血清轉氨酶可降至正常，無溶血表現，無特殊用藥史，血清銅藍蛋白和眼底檢查未見明顯異常。第3例患者存在非酒精性脂肪肝。

2.2 肝組織學表現第2例患者肝臟穿刺組織病理學檢查提示，肝細胞中度水腫變性，匯管區少許慢性炎細胞浸潤；第3例患者肝臟小葉內肝細胞單板排列，肝細胞輕度水腫，少量肝細胞內可見脂褐素樣色素沉積（圖1）。

圖1 肝組織學表現（HE，100×）

2.3 UGT1A1基因檢測情況3例患者均檢出UGT1A1基因5號外顯子存在c.1456 T＞G（p. Y486D）純合突變。Y486D位于第5外顯子上，使1456位胸腺嘧啶（T）突變為鳥嘌呤（G），導致486位氨基酸由酪氨酸（Tyr）變為天冬氨酸（Asp，圖2）。

圖2 UGT1A1基因參比序列（NM_000463）與患者UGT1A1基因測序結果比較

3 討論

CNS是UGT1A1基因突變使其酶活性完全或部分喪失而導致的遺傳性膽紅素代謝障礙性疾病，分為Ⅰ型和Ⅱ型，發病率為百萬分之一[5]。

UGT存在于肝細胞微粒體中，是生物體內進行第Ⅱ相生物轉化時最重要的酶之一[6]，代謝大量的外源性毒性物質和內源性物質。根據核苷酸序列的相似性，可將人類的UGT分為四類：即UGT1、UGT2、UGT3和UGT8，其中最重要的是UGT1和UGT2家族[7]。UGT1基因位于2q37，UGT1家族包括9個同工酶（UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9和UGT1A10）和4個假基因（UGT1A2P、UGT1A11P、UGT1A12P和UGT1A13P）[8]。只有UGT1A1編碼以膽紅素為底物的UGT1（B-UGT）[9]，因此UGT1A1基因突變可導致膽紅素代謝異常，表現為遺傳性高間接膽紅素血癥，如CNS和Gilbert綜合征（GS）。

自1992年[10]以來，已發現UGT1A1基因存在約140個不同的致病突變或變異位點[4]。CN-Ⅰ型是最嚴重的表型，而CN-Ⅱ型則介于CN-Ⅰ型和GS之間。多項研究發現，CN-Ⅱ型相關的分子學基礎主要是UGT1A1基因錯義突變及其他類型突變，可見于第1～5外顯子編碼區[3，11-16]，第5外顯子的第1456位T＞G（p.Y486D）即是突變位點之一。Y486D純合突變首先在日本CN-Ⅱ患者發現[17]，Yamamoto et al[18]對UGT1A1酶活性研究顯示，單一純合型Y486D的UGT1A1酶活性為正常野生型酶活性的（7.6± 0.5）%。雖然酶活性顯著下降但并未消失，可被苯巴比妥誘導，這也是CNS-Ⅱ型患者可用苯巴比妥治療的分子學基礎。本組3例患者雖未進行苯巴比妥誘導試驗，但是均檢出c.1456 T＞G（p.Y486D）純合突變，再結合患者臨床癥狀及TBIL水平，符合CN-Ⅱ型診斷。然而，既往報道中CN-Ⅱ型又以復合雜合突變較多[13，19]，主要基因型為G71R和Y486D突變，以亞洲地區報道最多見[3]。Maruo et al[13]報道1例患有CN-Ⅱ型的3月齡患兒，為復合雜合突變，體外酶活性研究顯示包含p.[G71R；Y486D]突變的UGT1A1酶活性是野生型的6.1%。

本文中第2和第3例患者肝臟穿刺病理學檢查提示肝細胞輕或中度水腫，匯管區少許慢性炎細胞浸潤，少量肝細胞內可見脂褐素樣色素沉積。這與前人研究結果類似。孫艷玲等[20]分析了155例先天性膽紅素代謝障礙性肝病的病理研究結果，其中包括GS 115例，CNS 5例。GS和CNS的組織學基本表現為肝組織內小葉結構均完整，中央區周圍/區域肝細胞漿內可見較細的棕褐色色素顆粒沉積，并且可存在肝細胞水樣變性、脂肪變性以及匯管區炎細胞浸潤。因此，這2例肝臟病理檢查也佐證了CNS的診斷。但是，單純依靠肝臟病理檢查，并不能完全區分出GS與CNS，故仍需進行分子遺傳學檢查。

目前，遺傳性非溶血性高間接膽紅素血癥的報道仍然較少，臨床醫生對于此類疾病的診斷較困難，即使已行肝臟穿刺病理檢查也并不一定能夠明確診斷。對于高度懷疑此類疾病的患者，應盡早行分子遺傳學檢查，確定基因突變位點，明確診斷并指導治療。

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（收稿：2016-04-21）

（本文編輯：陳從新）

Mutation of uridine diphosphate glucuronosyltransferase in three patients with Crigler-Najjar syndrom e type II

Shi Ping，Shen Jiandong，Liu Yao，et al.

Department of Infectious Diseases，First Affiliated Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu Province，China

Jiang Longfeng，E-mail：phoenix0929@126.com

Ob jec tive To investigate the diagnosis of patients with Crigler-Najjar syndrome type II（CNII）.M ethods Three patients with sustained unconjugated hyperbilirubinemia were admitted to our Department of Infectious Diseases，First Affiliated Hospital，Nanjing Medical University.The blood genome DNA was extracted，and five exons and their flanking sequences of uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1 gene（UGT1Al）were amplified by polymerase chain reaction and the products were directly sequenced.Results Substitution of thymine for guanine at loci 1456 in the 5th exon existed leading to the change of amino acid from tyrosine to aspartate at 486th position of the corresponding protein（c．1456T>G：p．Y486D）．So the three patients were confirmed with CN-Ⅱ．Conclusions A given patient with sustained unconjugated hyperbilirubinemia should be applied early to the gene analysis for the diagnosis of Crigler-Najjar syndrome.

Crigler-Najjar syndrome；Uridine diphosphate glucuronosyltransferase；Gene mutation

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.005

國家科技“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”重大專項（編號：2013ZX10002005）；江蘇省衛生計生委醫學創新團隊與領軍人才培養基金（編號：LJ201121）；中國肝炎防治基金會-天晴肝病研究基金（編號：CFHPC20132071）

210029南京市南京醫科大學第一附屬醫院感染病科（史萍，劉瑤，邵宇云，嚴友德，金柯，劉源，李軍，蔣龍鳳）；生殖醫學科（沈鑒東）

史萍，女，27歲，醫學碩士，住院醫師。E-mail: shiping0218@126.com

蔣龍鳳，E-mail:phoenix0929@126.com