慢性乙型肝炎患者血清脂質組學研究*

楊蕊旭，胡春秀，陳國鳳，孫長貴，孫婉璐，陳光榆，潘勤，沈峰，許國旺，范建高

·乙型肝炎·

慢性乙型肝炎患者血清脂質組學研究*

楊蕊旭，胡春秀，陳國鳳，孫長貴，孫婉璐，陳光榆，潘勤，沈峰，許國旺，范建高

目的通過血清脂質組學分析，研究CHB患者脂質代謝特征。方法在健康人（n=23）和肝活檢證實的CHB患者（n=17），采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定血清脂質組學代謝產物；構建正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型，結合單因素分析篩選差異脂質。結果CHB組與健康人脂質代謝輪廓有顯著性差異［OPLS-DA: R2=0.775，Q2=0.518，P（CV-ANOVA）=2.81× 10-4］，篩選出64種顯著改變的脂質（VIP＞1，P＜0.05）。其中包括游離脂肪酸（FFA）、二酰甘油（DAG）、三酰甘油（TAG）、膽固醇酯（CE）、神經酰胺（Cer）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰肌醇（PI）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、縮醛磷脂酰乙醇胺（PlsEtn）等；CHB組DAG、CE、LPC、PlsEtn、Cer顯著降低（均值較健康人降低百分比分別為18%、17%、10%、32%和29%，P＜0.05）；TAG中含高碳原子數目、多不飽和鍵脂肪酸的TAG降低（P＜0.05）；飽和以及單不飽和鍵的PC升高，含多不飽和鍵的PC下降（P＜0.05）；CHB組游離單不飽和脂肪酸（F-MUFA）較健康人升高36%（P＜0.05），且與METAVIR肝組織炎癥活動和纖維化評分呈正相關（Spearman相關性分析：活動性r=0.527，P＜0.05，纖維化r=0.540，P＜0.05）。結論CHB患者脂質代謝與正常人有顯著差異，脂質組學分析可能為評價肝臟炎癥活動和纖維化程度提供無創診斷依據。

慢性乙型肝炎；脂質組學；超高效液相色譜；串聯質譜

在全球范圍內，乙型肝炎病毒感染是慢性肝病的重要病因之一[1]。在我國，慢性乙型肝炎（CHB）是主要的導致肝硬化及肝細胞癌的疾病[2]。肝活檢作為評估肝臟炎癥活動度和纖維化程度的金標準，但因取樣誤差或可能存在的并發癥等原因在臨床上應用受限，而血清無創診斷研究如血清標志物、血清診斷模型、組學等在慢性肝病的評估中具有無創性、可重復性等優點而逐漸受到重視[3]。脂質組學作為代謝組學的重要分支，可定性定量地研究生物體脂質代謝產物，可為疾病脂質代謝特征的評估、發病機制的研究、血清標志物的篩選提供新的研究策略[4]。本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析了CHB患者和健康成人血清脂質組學狀況，旨在探討CHB患者脂質代謝的特點，并初步分析其作為判斷CHB患者肝臟炎癥活動和纖維化程度診斷的潛在指標的可能性。

1 資料與方法

1.1 研究對象2012年1月至2013年6月于上海新華醫院和北京解放軍第302醫院診治的CHB患者17例，男性9例，女性8例；平均年齡（38.2± 3.3）歲。診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南》標準診斷，即既往有乙型肝炎病史或者HBsAg陽性超過6個月，現血清HBsAg和（或）HBV DNA陽性，肝活檢組織病理學檢查提示慢性肝炎[5]。排除其它嗜肝病毒感染、先天性、自身免疫性、藥物、毒物、酒精性肝病和糖尿病。另選23例健康成人，男性14例，女性9例；平均年齡（39.9±1.2）歲，無酒精濫用（每日飲酒量小于20克乙醇）、慢性肝病病史，肝功能正常，腹部超聲和Fibroscan檢測正常。本研究得到我院醫學倫理委員會批準，受試者給出知情同意書，并遵照《赫爾辛基宣言》的原則實施研究。

1.2 檢測和檢查使用7600-120型自動生化分析儀（日本HITACHI公司）檢測肝功能、血脂、空腹血糖；使用Fibroscan（法國Echos公司）檢測肝硬度(LSM)和受控衰減參數（CAP）。對CHB患者采用18 G一次性活檢穿刺針（美國BARD生物系統公司）在超聲定位下行肝臟穿刺，病理標本經3名病理學專家采用METAVIR評分系統進行分級分期。

1.3 血清脂質組學分析在采樣前，要求研究對象避免劇烈運動、飲酒和咖啡等。采集空腹靜脈血。采用甲基叔丁基醚（MTBE）-甲醇提取體系預處理血清。為評價測定過程的穩定性，將質量控制（QC）樣本穿插在分析序列中。采用超高效液相色譜（美國Waters）和四級桿飛行時間串聯質譜儀（TripleTOF 5600，美國AB SCIEX）測定。色譜條件：色譜分離柱UPLC ACQUITY C18（2.1 mm× 100 mm×1.7μm），柱溫55℃，流動相A:乙腈/水（比例3/2），流動相B:異丙醇/乙腈（比例9/1），流動相A、B含10 mM乙酸銨，流速：0.26 ml/min。質譜條件：ESI正負離子掃描模式。質譜參數：離子源電壓分別為4500 V（-）和5500 V（+），去簇電壓為100 V（-）和100 V（+），接口加熱器溫度為600℃（-）和500℃（+）。應用Analyst TF、LipidView、PeakView、MultiQuant系列軟件（美國AB SCIEX）采集數據、定性、定量分析。

1.4 統計學處理應用SIMCA-P 13.0（瑞典Umetrics）進行多元統計分析。采用UV轉換數據，構建正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）模型，進行總結、分類及判別分析，采用7次交叉驗證檢測模型可靠性。根據OPLS-DA模型得到變量權重值（VIP），初步篩選CHB患者血清顯著變化的代謝物。應用SPSS 22.0（美國SPSS）對原始數據進行分析，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗（正態分布的數據）或Mann-Whitney U檢驗（非正態分布數據）進行單因素分析，計數資料以百分比表示，采用卡方檢驗，聯合VIP值＞1和P＜0.05篩選差異脂質。

2 結果

2.1 一般情況與健康人比，CHB患者血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、谷氨酰轉肽酶等指標和LSM顯著升高（P＜0.05），而BMI、白蛋白、膽固醇、載脂蛋白則較健康人低（P＜0.05），兩組性別、年齡、腰圍、空腹血糖，CAP等指標則無顯著性差異（P＞0.05，表1）。

表1 研究對象基本資料（n,±s）

表1 研究對象基本資料（n,±s）

與健康人比，①P＜0.05 BMI:體質指數；LSM:肝臟硬度測定；CAP：受控衰減參數

2.2 脂質組學多元分析結果基于UPLC-MS/MS分析40例研究對象血清，共定性定量檢出239種脂質。質量控制樣本99%離子峰面積的相對標準偏差（RSD）＜30%，表明所測得的代謝物整體表現穩定。數據經過UV轉換后，建立OPLS-DA模型得分圖（圖1），可見CHB組與健康人血清脂質分布有明顯差異。7次交叉驗證所得模型穩定性指標R2=0.775，預測性指標Q2=0.518，說明模型分類預測性和可重復性較高；P（CV-ANOVA）=2.81×10-4，表明組別分離程度顯著。結合VIP值與單因素分析，篩選出64種差異脂質。顯著差異的分子主要包括長鏈多不飽和鍵的三酰甘油（TAG）下降，飽和以及單不飽和鍵的磷脂酰膽堿（PC）升高，多不飽和鍵的PC下降，部分分子量的二酰甘油（DAG）、膽固醇酯（CE）、神經酰胺（Cer）、鞘磷脂（SM）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（PlsEtn）下降，部分分子量的磷脂酰肌醇（PI）升高（表2）。

圖1 慢性乙型肝炎和健康人OPLS-DA得分圖

表2 慢性乙型肝炎與健康人差異脂質代謝產物比較

表2 續表

2.3 CHB患者血清脂質組學改變CHB患者血清總脂質與健康人比無統計學差異（P＞0.05）；CHB患者游離單不飽和脂肪酸（F-MUFA）較健康人顯著升高（P＜0.05）；CHB患者DAG（P＜0.05）和CE（P＜0.005）較健康人顯著下降。在鞘脂中，乙型肝炎患者Cer和部分SM較健康人顯著降低（P＜0.005,圖2A、B，表2）。在磷脂中，CHB患者LPC（P＜0.05）和縮醛磷脂，如PlsEtn（P＜0.005）較健康人顯著下降，總PC、PE、PI與健康人比無統計學差異（P＞0.05）；PC/PE比值較健康人顯著下降（P＜0.05）。慢性乙型肝炎患者高碳原子數目和大于三個不飽和鍵數目的TAG較健康人顯著下降（P＜0.05,圖2C、D，表2）。

圖2 慢性乙型肝炎患者血清脂質代謝的變化

2.4 不同肝組織病理學評分患者血清脂質分析根據METAVIR評分系統評價CHB患者肝組織炎癥活動度，將慢性乙型肝炎患者分為低炎癥活動組（METAVIR活動性0～1分）10例和高炎癥活動組（METAVIR活動性2～3分）7例，發現高炎癥活動組F-MUFA較低炎癥活動組顯著升高（P＜0.05，圖3A）；以F-MUFA（＞1.215）區別不同炎癥程度的AUC為0.883（95%CI:0.717～1.000），相關性分析提示F-MUFA與活動性評分呈正相關（Spearman相關性分析：r=0.527，P=0.036）；11例慢性乙型肝炎顯著纖維化（METAVIR纖維化2～4分）患者F-MUFA水平較6例非顯著纖維化（METAVIR纖維化0～1分）患者顯著升高（P＜0.05，圖3B）；以F-MUFA（＞1.346）區別不同纖維化程度的AUC為0.800（95%CI: 0.570～1.000），且F-MUFA與纖維化評分呈正相關（Spearman相關性分析：r=0.540，P=0.032）。

圖3 不同肝組織炎癥活動度和纖維化程度CHB患者血清游離單不飽和脂肪酸水平比較

3 討論

有研究報道CHB患者肝脂肪變與代謝因素相關而與病毒因素不相關[6]。亦有研究報道，慢性HBV感染與代謝綜合征的發生呈負相關[7]，CHB患者血清TAG水平、HDL水平較非感染者降低，而血清脂聯素、內脂素升高，且與病毒載量相關[8，9]。另一方面，有研究報道CHB患者合并代謝綜合征可促進肝纖維化的發展[10]。

CHB患者血清含高碳原子數目和多不飽和鍵的TAG顯著下降，意味著長鏈多不飽和脂肪酸減少，可能與慢性炎癥使細胞抗氧化能力、細胞增殖和存活能力改變有關。慢性HBV和HCV感染者多不飽和脂肪酸的補充可減少肝細胞癌發生的風險[11]。CHB組F-MUFA較健康人顯著升高，意味著硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）活性升高。SCD1作為飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉化的重要限速酶，其活性與脂質代謝密切相關，可能成為一個治療靶點[12]。

鞘脂是細胞膜和脂蛋白的組成部分，同時也參與細胞增殖分化、細胞內外信號傳導、細胞凋亡等過程的調控。CHB和肝硬化患者SM水平下降[13]。本研究發現，CHB組多數Cer和SM較健康人顯著降低，可能與SM水解增多，合成受抑制有關。CHB組超長鏈Cer顯著降低，而長鏈Cer與超長鏈Cer有相反的生理特性，長鏈Cer升高與超長鏈Cer下降可促進細胞凋亡[14]。血清特定分子量Cer和SM與HBV感染導致的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）MELD評分、肝活檢炎癥分級以及預后呈負相關[15,16]。本研究發現Cer和SM在CHB患者下降，但與肝臟組織炎癥和纖維化程度以及HBV DNA水平并無顯著性相關。

本研究CHB組多數LPC較健康人下降。LPC作為與細胞增殖、炎癥相關的重要信號分子，在慢性肝病和肝細胞癌患者下降[17]，而PlsEtn作為縮醛磷脂，是內源性抗氧化劑，與細胞抗氧化能力相關[18]。CHB組PLsEtn下降可能意味著抗氧化能力下降。含飽和以及單不飽和鍵的PC升高，說明脂質從頭合成過程增多，而作為細胞膜的組成部分，多不飽和PC下降可導致細胞膜結構流動性下降和抗氧化能力下降。PC/PE比值下降意味著PE生成增多、PC生成減少或者磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶（PEMT）活性降低，導致PE向PC轉換減少。該酶表達的減少往往與內質網應激、肝細胞增生以及肝細胞癌的發生相關[19，20]。

通過UPLC-MS/MS技術對CHB患者血清脂質組學的分析發現CHB患者脂類代謝如三酰甘油、鞘脂、磷脂分布、縮醛磷脂以及脂肪酸等的代謝有顯著改變，這些脂質代謝的差異可能與CHB患者細胞凋亡、增生、抗氧化能力改變相關。結合CHB患者肝臟組織炎癥、纖維化程度與脂質相關性的分析，可為尋找潛在的無創診斷血清標志物提供依據。

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（收稿：2016-05-17）

（本文編輯：陳從新）

Serum lipidom icanalysis of patients with chronic hepatitis B

Yang Ruixu，Hu Chunxiu，Chen Guofeng，et al.Center for Fatty Liver Study，

Department of Gastroenterology，XinHua Hospital，Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Fan Jiangao.E-mail:fattyliver2004@126.com

Objective The aim of this study was to investigate serum lipid profiling of patients with chronic hepatitis B（CHB）.M ethods A ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/ MS）platform was applied for serum lipid profiling in 17 patients with CHB and 23 healthy volunteers.Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）model and univariate analysis were established to analyze the characteristic metabolites and the association with histological severities.Resu lts There were significant lipids changes in the CHB patients［OPLS-DA:R2=0.775，Q2=0.518，P（CV-ANOVA）=2.81×10-4］，and 64 lipids with significant differences（VIP＞1，P＜0.05）between the two groups were found；These lipids belonged to categories of free fatty acid（FFA），triglyceride（TAG），diglyceride（DAG），cholesterol ester（CE），ceramide（Cer），sphingomyelin（SM），phosphatidylcholine（PC），phosphatidylinositol（PI），lysophosphatidylcholine（LPC），ethanolamine plasmalogen（PlsEtn）；There were lower levels of CE，DAG，Cer，LPC，PlsEtn in CHB（decreased by 18%，17%，10%，32%and 29%，P＜0.05）；TAG with higher carbon numbers and double bonds significantly decreased（P＜0.05）；PC with lower double bonds significantly increased and PC with higher double bonds decreased（P＜0.05）；The free monounsaturated fatty acids increased in CHB（increased by 36%，P＜0.05）and were positively correlated with the METAVIR inflammation and fibrosis scores（Spearman correlation r=0.527，P＜0.05 in activity，r=0.540，P＜0.05 in fibrosis）. Conclusion The patients with CHB have numerous changes in lipid metabolism，and the lipidomic profiling may provide possible non-invasive method for the evaluation of hepatic injuries in patients with CHB.

Hepatitis B；Lipidom ics；Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.006

國家973課題（編號：2012CB517501）；國家自然科學基金資助項目（編號：81270491/81470840）；上海市科委重點項目（編號：10411956300）；上海市衛生系統優秀學科帶頭人計劃（編號：XBR2011007）

200092上海市上海交通大學醫學院附屬新華醫院消化內科暨脂肪肝診治中心（楊蕊旭，孫婉璐，陳光榆，潘勤，沈峰，范建高）；中國科學院大連化學物理研究所/中國科學院分離分析化學重點實驗室（胡春秀，許國旺）；解放軍第302醫院肝纖維化診療中心（陳國鳳）；江蘇省昆山市錦溪人民醫院（孫長貴）

楊蕊旭，女，25歲，博士研究生。主要從事非酒精性脂肪性肝病相關研究。E-mail:ruixu.yang@hotmail.com

范建高，E-mail:fattyliver2004@126.com