不同濃度CCl4注射聯合飲用乙醇誘導大鼠肝硬化模型研究

翟偉，刁廣浩，李瑞生，張紹庚，王兆海

·短篇論著·

不同濃度CCl4注射聯合飲用乙醇誘導大鼠肝硬化模型研究

翟偉，刁廣浩，李瑞生，張紹庚，王兆海

目的探索不同濃度CCl4聯合飲用乙醇制備大鼠肝硬化模型，尋求最佳的藥物和乙醇濃度。方法取90只SD大鼠,分為對照組10只和實驗組A組、B組、C組和D組，每組20只，給予不同濃度的CCl4油溶液腹腔注射，同時以不同濃度的乙醇溶液為飲用水，制備肝硬化模型。結果在實驗12 w末，A組大鼠死亡10只,B組死亡8只,C組死亡4只，D組死亡5只；實驗A組肝細胞走向紊亂，纖維組織增生，纖維間隔形成。有假小葉形成，肝細胞大小不一，呈點灶狀壞死，肝細胞凋亡、再生，匯管區內炎細胞浸潤；B組與A組變化相似；C組肝細胞走向紊亂，纖維間隔形成，但無假小葉形成，肝細胞脂肪變性，纖維組織增生，肝細胞凋亡，匯管區內炎細胞浸潤；D組與C組表現類似。結論適當濃度的CCl4油溶液結合乙醇溶液為飲用水誘導大鼠肝硬化模型可顯著提高造模成功率。

肝硬化；四氯化碳；乙醇；大鼠

建立理想的肝硬化動物模型不僅是進行肝病實驗研究的基礎，也是臨床評價肝硬化診斷和治療方法的有效手段之一［1-6］。本實驗采用皮下注射CCl4油溶液結合飲用乙醇制作肝硬化大鼠模型，觀察了肝組織結構的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與藥品3～4周齡健康雄性SD大鼠90只,體質量100～150 g,由我院動物實驗中心提供，采取人工光照，明、暗各12 h，溫度24～26℃，濕度50%～60%，噪音＜50db，每個鼠籠放置少于4只大鼠。對大鼠的處置按照中華人民共和國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》的相關規定進行，全程符合動物倫理學管理要求。四氯化碳（分析純）由解放軍軍事醫學科學院提供；市售某品牌中性菜籽食用油；苯巴比妥鈉（0.1 g/1 m l）由軍事醫學科學院提供；3%戊巴比妥鈉溶液由軍事醫學科學院提供；市場銷售的某品牌飲用白酒（乙醇含量為60%）。

1.2 肝硬化模型的制備將動物分為實驗組80只和對照組10只。給予實驗組動物每升蒸餾水中含0.35 g苯巴比妥鈉的溶液代替飲用水飲用2 w。將實驗組動物分為4組，每組20只。給予A組動物50%四氯化碳中性菜籽油溶液0.5 ml/100 g體質量腹腔注射,2次/w,并以10%乙醇溶液為其惟一飲用水，持續12 w；給予B組動物四氯化碳中性菜籽油溶液同A組,但以蒸餾水為其惟一飲用水；給予C組33%四氯化碳中性菜籽油溶液0.5 m l/100 g體質量腹腔注射,2次/w,以10%乙醇溶液為其惟一飲用水，持續12 w；給予D組四氯化碳中性菜籽油溶液同C組,以20%乙醇溶液為其惟一飲用水；給予對照組普通顆粒飼料喂養，正常飲蒸餾水。在實驗第12 w末，處死大鼠,開腹，取肝組織行石蠟包埋、切片、HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 病死率對照組大鼠無死亡；在誘導12周過程中，20只A組大鼠死亡10只（50%）；20只B組大鼠死亡8只（40%）；20只C組大鼠死亡4只（20%）；20只D組大鼠死亡5只（25%）。

2.2 組織病理學表現對照組大鼠肝組織肝小葉結構完整，肝板條索狀以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無肝細胞變性、壞死（圖1）；實驗A組肝細胞走向紊亂，纖維組織增生，纖維間隔形成。有假小葉形成，肝細胞大小不一，呈點灶狀壞死，肝細胞凋亡、再生，匯管區內炎細胞浸潤（圖2、圖3）；B組與A組變化相似；C組肝細胞走向紊亂，纖維間隔形成，但無假小葉形成，肝細胞脂肪變性，纖維組織增生，肝細胞凋亡，匯管區內炎細胞浸潤；D組與C組表現類似（圖4、圖5）。

3 討論

肝硬化動物模型的制作方法包括血吸蟲尾蚴法[7]、四氯化碳法[8]、硫代乙酰胺法[9]、低劑量長期應用致癌物法[10]、膽總管結扎法[11]和乙醇性[12]肝硬化模型等。

本實驗通過腹腔注射不同濃度的CCl4，結合飲用乙醇制備大鼠肝硬化模型，出現明顯的肝細胞點、灶狀壞死及纖維性變，肝細胞走向紊亂，纖維組織增生，纖維間隔形成，假小葉形成，肝細胞大小不一，呈點灶狀壞死，肝細胞凋亡、再生，匯管區內炎細胞浸潤，提示肝硬化病變制備成功。肝纖維化是肝臟進一步向肝硬化發展的重要環節，其主要表現在肝內纖維組織增生和纖維間隔形成，它是對各種原因所致肝損傷的創傷愈合反應，同時也是慢性肝病的重要病理特征。

圖1 對照組大鼠肝組織學表現肝小葉結構完整，肝細胞無變性、壞死（HE，10×）

圖2 實驗A組大鼠肝組織學表現肝細胞走向紊亂，纖維間隔形成，有假小葉形成（（HE，10×）

圖3 實驗A組大鼠肝組織學表現肝細胞走向紊亂，纖維間隔形成，伴假小葉形成（HE，20×）

圖4 實驗C組大鼠肝組織學表現肝細胞走向紊亂，細胞變性、壞死，纖維間隔形成，成熟假小葉形成（HE，10×）

圖5 實驗C組大鼠肝組織學表現肝細胞走向紊亂，細胞變性、壞死，纖維間隔形成，成熟假小葉形成（HE，20×）

四氯化碳是使用最早、最廣泛的肝纖維化誘導劑[11]。四氯化碳誘導慢性肝損傷的機理是直接損害肝細胞,破壞細胞的各種成分,造成肝細胞的脂肪變性和壞死。乙醇為酶誘導劑,損害線粒體,增加肝細胞氧耗量,還可增強四氯化碳對肝細胞的毒性作用,兩者同時作用可促進肝硬化的形成[12]。

本實驗對四氯化碳的濃度及飲用乙醇溶液濃度進行了改進，探討了最合適的四氯化碳濃度誘導肝硬化大鼠模型，同時以不同濃度的乙醇溶液為飲用水，持續12周，觀察大鼠肝硬化模型制備的成功率及動物死亡率。實驗證明,適當濃度的四氯化碳油溶液能顯著增加肝硬化模型的成功率，而對大鼠的死亡率無明顯影響，同時適當濃度的乙醇溶液可以加快大鼠的適應期，減少大鼠拒飲現象，更好地誘導肝硬化模型，而高濃度的四氯化碳直接注射可以導致部分大鼠出現急性肝功能衰竭而死亡,而稍高濃度的乙醇溶液對大鼠的肝硬化成模無明顯影響，且部分大鼠拒絕飲用高濃度乙醇亦可導致死亡[13]，適當濃度的四氯化碳和乙醇可以維持對肝細胞的損害強度,因脂肪氧化減少,肝細胞內脂肪堆積,肝細胞破壞,假小葉形成,造成肝硬化的形成。本實驗成功地制備了大鼠肝硬化模型,為以后研究肝硬化打下了基礎。

[1]李小杉，肖靜，高月霞.原發性肝癌患者生存質量研究新進展.實用肝臟病雜志2011，14（3）:236-238.

[2]顧永珍.原發性肝癌的手術治療與臨床分析.吉林醫學，2011，32（3）:535-536.

[3]歐陽兵，吳威，徐政光.肝硬化合并肝癌患者出現低血糖的臨床表現.當代醫學，2010，16（28）:45－46.

[4]郭若涵，白彬.大型動物實驗性肝纖維化及肝硬化模型的研究進展.世界華人消化雜志，2014，21（5）:421－426．

[5]李棟，張樂玲，侯懷水，等.四氯化碳誘導兔肝硬化模型的動態研究.世界華人消化雜志，2006，14（14）:1403-1407.

[6]Chatterjee S，Vrolix G，Depoortere I，et al．The therapeutic effect of the neuropeptide hormone somatostatin on Schistosoma mansoni caused liver fibrosis．BMC Infect Dis，2005，2（5）: 45-46.

[7]Kang JS，Wanibuchi H，Morimura K，et al．Enhancement by estradiol 3－benzoate in thioacetamide-induced liver cirrhosis of rats．Toxicol Sci，2005，85（1）:720－726.

[8]Sakaida I，Hironaka K，Terai S，et al．Gadolinium chloride reverses dimethylnitrosamine（DMN）-induced rat liver fibrosis with increased matrix metalloproteinases（MMPs）of Kup ffer cells．Life Sci，2003，72（8）:943－959.

[9]Brnd L，Hadrup N，Salling N，et al．Uncoupling of vasopressin signaling in collecting ducts from rats with CBL－induced liver cirrhosis．Am J Physiol Renal Physiol，2004，287（4）:F806－F815.

[10]Li J，Niu JZ，Wang JF，et al．Pathological mechanisms of alcohol-induced hepatic portal hypertension in early stage fibrosis rat model．World J Gastroenterol，2005，11（41）: 6483－6488.

[11]Cutrin C，Menino MJ，Perez-Becorra E，et al.Lactacidaemia and perivenular fibrosis in an experimental model of cirrhosis in rats given carbon tetrachloride and ethanol.Med Sci Res，2014，20（8）:587-588.

[12]Chatamra K，Proctor E.Phenobarbitone-inducded enlargement of the liverin the rat:its relationship to carbon tetracholrideinduced cirrhosis.Br J Exp Path，2013，62（5）:283-288.

[13]Chae HB，Jang LC，Park SM，et al.An experimental model of hepatic fibrosis induced by alcohol and CCl4:can the lipopolysaccharide prevent liver injury induced by alcohol and CCl4.Taehan Kan Hakhoe Chi，2013，8（2）:173-178.

（收稿：2016-05-06）

（本文編輯：陳宗炳）

A lcohol and CCl4-induced liver cirrhosis in rats

Zhai Wei,Diao Guanghao,Li Ruisheng,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,302nd Hospital,Beijing 100071

Liver cirrhosis;Alcohol;CCl4;Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.018

100071北京市解放軍第302醫院肝膽外科一中心

翟偉，男，28歲，碩士研究生，住院醫師。主要從事肝膽外科診斷與治療學研究。E-mail:624229727@qq.com

王兆海，E-mail:pla302wzh@163.com