人A431皮膚鱗狀細胞癌中絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路對P53的調節作用

郝玉琴，康春義，張鑫，康淑霞，劉俠（.內蒙古醫科大學第三附屬醫院（包鋼醫院）皮膚科，內蒙古包頭0400；.內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特000）

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人A431皮膚鱗狀細胞癌中絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路對P53的調節作用

郝玉琴1，康春義1，張鑫2，康淑霞2，劉俠2
（1.內蒙古醫科大學第三附屬醫院（包鋼醫院）皮膚科，內蒙古包頭014010；2.內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特010110）

摘要：目的觀察絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（MAPK/ERK）信號通路的活化及抑制對皮膚鱗狀細胞癌（SCC）細胞增殖、凋亡情況的影響，探討MAPK/ERK信號通路與抑癌基因P53在皮膚SCC中的相互作用機制。方法培養人A431皮膚SCC細胞株，分為低、中、高濃度的MAPK/ERK通路抑制劑（PD98059+DMSO）組及激活劑（IGF+PBS）組、空白對照（DMSO）組。噻唑藍法檢測細胞體外增殖活力，流式細胞術（FCM）檢測細胞的凋亡，Western blot檢測各組A431細胞中P-ERK、P53蛋白表達。結果經不同濃度的抑制術PD98059處理A431細胞，細胞增殖受到抑制，呈濃度-效應和時間-效應關系（P<0.05）；經不同濃度的激動劑胰島素樣生長因子（IGF）處理A431細胞，細胞增殖受到促進，呈濃度-效應和時間-效應關系（P< 0.05）。FCM檢測結果顯示，PD98059作用于A431細胞，細胞凋亡率明顯增高，呈濃度-效應關系（P<0.05）；而IGF作用于A431細胞，細胞凋亡率明顯降低，呈濃度-效應關系（P<0.05）。Western blot檢測結果顯示，PD98059處理A431細胞，P-ERK蛋白的表達降低，P53蛋白的表達增強，隨著PD98059濃度的增加，P-ERK蛋白明顯降低，P53蛋白明顯增強（P<0.05）；而IGF處理A431細胞，P-ERK蛋白的表達增強，P53蛋白的表達降低，隨著IGF濃度的增加，P-ERK蛋白明顯增強，P53蛋白明顯降低（P<0.05）；經過Pearson相關性分析，P53 與P-ERK的表達呈負相關（P<0.05）。結論人A431細胞中MAPK/ERK信號通路被IGF激活后，促凋亡因子P53表達降低，細胞增殖能力增強，凋亡能力降低；而該通路受抑制后，促凋亡因子P53表達增高，細胞增殖能力降低、凋亡能力增強。

關鍵詞：皮膚鱗狀細胞癌；絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶信號通路；P53

惡性腫瘤的發生、發展涉及一系列信號轉導分子活性的改變。其中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信號轉導通路的持續活化是人類許多腫瘤的一個顯著標志，其異常活化能導致細胞喪失凋亡和分化的能力，促使細胞惡性轉化，異常增殖，產生腫瘤[1]。所以認為，靶向破壞該通路中的任何一個環節都能阻斷該信號途徑，抑制腫瘤細胞的增殖。本課題組及其他學者通過對某些腫瘤細胞的體內外研究卻發現，腫瘤細胞經某些抗腫瘤藥物治療后，可以引起MAPK/ERK轉導通路的活化和轉錄，同時啟動P53依賴性凋亡途徑，進而促進腫瘤細胞凋亡[2-6]。因此，MAPK/ERK轉導通路與抑癌基因P53在惡性腫瘤中增殖、凋亡平衡中的作用值得探索，為研究MAPK/ERK信號轉導通路提出新的挑戰。目前，有關皮膚鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）中MAPK/ERK信號通路與P53作用的研究未見報道。因此，本研究通過應用MAPK/ERK信號通路激活劑類胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）及抑制劑PD98059干預人A431皮膚SCC細胞株，觀察MAPK/ERK信號通路的活化及抑制對皮膚SCC細胞增殖、凋亡的影響，探討MAPK/ERK信號通路與抑癌基因P53在皮膚SCC中的相互作用機制，為補充SCC的發生機制及治療策略具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

IGF-1購自深圳晶美生物工程公司，PD98059購自美國Promega公司，胎牛血清、無血清細胞凍存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）高糖培養基、胰酶及無線電免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）細胞裂解液為美國Invitrogen公司產品，Annexin-V-FITC細胞凋亡試劑盒為南京凱基生物科技發展有限公司產品，四甲基偶氮唑藍購于美國Sigma公司，兔抗鼠p53（BA0521）及P-ERK一抗為武漢博士德生物工程有限公司產品，增強化學發光法（enhanced chemilumnescence，ECL）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒為美國Amersham Life Sciences公司產品，96孔反應板購自德國Roche公司。

1.2細胞培養

人A431皮膚SCC細胞株[購于南通百奧邁科（Biomics）生物技術有限公司，貨號：CRL-1555，來源于美國ATCC公司]貼壁培養于DMEM（高糖型）完全培養基（含10％小牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）中，置37℃、飽和濕度、5％二氧化碳CO2培養箱內培養，每1～2 d換液1次，細胞單層貼壁生長，待長滿瓶底時，用0.25％胰蛋白酶消化液消化成單個細胞，取對數生長期的細胞準備實驗。

1.3試驗方法

實驗分為低、中、高濃度的抑制劑（PD98059+DMSO）組及激活劑（IGF+PBS）組、空白對照（DMSO）組。抑制劑組PD98059濃度依次為25、50及100μmol/L；激活劑組IGF濃度依次為40、80及120 ng/ml。

1.3.1噻唑藍比色法檢測細胞體外增殖活力取處于對數生長期、生長狀態良好的A431細胞以每孔1×104個細胞接種于96孔培養板中，每孔培養基體積200μl。待A431細胞貼壁24 h后，將不同濃度的藥物PD98059或IGF加入A431細胞，37℃、5％CO2培養箱中繼續培養至24、48及72 h，每孔加20μl MTT溶液（5 mg/ml），37℃孵育4 h，棄上清液，每孔加150μl DMSO，振蕩10 min，酶標儀測490 nm各孔光吸收值OD，實驗重復3次，取3次結果的平均值，記錄結果，以未加藥細胞組作為空白對照組，計算細胞增殖抑制率/存活率，增殖抑制率（proliferation inhibitory rate，PIR）=（1-藥物組OD/對照組OD）×100％；存活率（survival rate，SR）=藥物組OD/對照組OD×100％，對照組SR為100％。

1.3.2流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測細胞凋亡取生長狀態良好的A431細胞加入PD98059 或IGF藥物48 h后進行流式凋亡檢測，獨立實驗3次。具體步驟如下：各組細胞經0.2％胰酶處理，離心收集細胞，用4℃預冷PBS洗滌2次，調節其濃度為1×106/ml，取100μl細胞懸浮于5 ml流式管中，加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入5μl碘化丙啶（propodium iodide，PI）混勻，于室溫避光孵育15 min。隨后重懸于400μl PBS，400目篩網過濾，加樣于流式細胞儀檢測細胞凋亡。激發波長Ex= 488 nm，發射波長Em=530 nm。獲得細胞凋亡數據后用ModFit LT軟件進行細胞凋亡相對定量分析。

1.3.3凋亡相關因子的測定采用Western blot檢測P53、P-ERK蛋白的表達，取生長狀態良好的A431細胞加入PD98059或IGF藥物48 h后進行Western blot檢測。RIPA細胞裂解液抽提各組細胞總蛋白，按BCA試劑盒說明書操作步驟測定總蛋白含量后分裝，置入-80℃冰箱冷凍待用。分別取50μg各組蛋白，煮沸10 min變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，電泳結束后，通過電轉移法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜在含10％脫脂奶粉的PBST中4℃封閉過夜后，PBST充分漂洗（10 min×3次），分別加入兔抗鼠P53、P-ERK（1∶300稀釋）和兔抗鼠β-actin抗體（1∶800稀釋），37℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次），加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶1 000稀釋），37℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次）后，化學熒光法（ECL試劑盒，美國Amersham Life Sciences公司產品）顯色，利用Image J灰度分析軟件對Western blot檢測結果作半定量分析。每份樣品均設3個重復。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組間數據的比較用方差分析及Pearson相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1MAPK/ERK信號通路的活化或抑制對細胞增殖的作用

MTT結果顯示，不同濃度的MAPK/ERK通路抑制劑PD98059處理不同時間的A431細胞，細胞增殖均受抑制。隨著PD98059濃度的增加和作用時間的延長，PIR逐漸增加，呈濃度-效應和時間-效應關系（P<0.05）。見表1。

表1　PD98059對A431細胞增殖抑制率的作用

經不同濃度的MAPK/ERK通路激動劑IGF處理不同時間的A431細胞，可促進細胞增殖。隨著IGF濃度的增加和作用時間的延長，SR逐漸增加，呈濃度-效應和時間-效應關系（P<0.05）。見表2。

表2　IGF對A431細胞存活率的作用

2.2MAPK/ERK信號通路的活化或抑制對細胞凋亡的作用

FCM檢測結果顯示，MAPK/ERK通路抑制劑PD98059作用于A431細胞，細胞凋亡率明顯增高，隨著藥物濃度的增加，凋亡率明顯增加，呈濃度-效應關系，各組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；而MAPK/ERK通路激動劑IGF作用于A431細胞，細胞凋亡率明顯降低，隨著藥物濃度的增加，凋亡率明顯降低，呈濃度-效應關系，其中中劑量、高劑量組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3　PD98059/IGF誘導A431細胞凋亡

2.3相關凋亡因子P53、P-ERK蛋白的表達

2.3.1Western blot檢測各抑制劑組P-ERK、P53蛋白的表達經不同濃度的MAPK/ERK通路抑制劑PD98059處理A431細胞，P-ERK蛋白的表達均降低，P53蛋白的表達均增強。隨著PD98059濃度的增加，P-ERK蛋白明顯降低，P53蛋白明顯增強，與空白對照組比較，差異有統計學意義（FP-ERK=82.376，FP53=737.821，P<0.05）（見圖1和表4）。

圖1　PD98059各抑制劑組P53和P-ERK蛋白的表達

表4　不同濃度PD98059對A431細胞P-ERK、P53蛋白表達的作用（±s）

表4　不同濃度PD98059對A431細胞P-ERK、P53蛋白表達的作用（±s）

注：覮與對照組比較，P<0.05

PD98059　P-ERK/β-actin蛋白的表達　P53/β-actin蛋白的表達0μmol/L　0.887±0.070　0.155±0.006 25μmol/L　0.725±0.037覮　0.436±0.014覮F值　82.376　737.821 P值　0.000　0.000 50μmol/L 100μmol/L 0.548±0.066覮0.247±0.018覮0.843±0.134覮0.998±0.038覮

2.3.2Western Blot法檢測各激動劑組P-ERK、P53蛋白的表達經不同濃度的MAPK/ERK通路激動劑IGF處理A431細胞，P-ERK蛋白的表達均增強，P53蛋白的表達均降低。隨著IGF濃度的增加，P-ERK蛋白明顯增強，P53蛋白明顯降低，與空白對照組比較，差異有統計學意義（FP-ERK=534.577，FP53= 174.292，P<0.05）（見圖2和表5）。

2.3.3各組A431細胞中P53與P-ERK蛋白表達的相關性分析通過觀察發現，PD98059處理A431細胞，隨P-ERK蛋白表達的降低，P53蛋白的表達升高，經過Pearson相關性分析，P53與P-ERK的表達呈負相關（rPD98059=-0.955，PPD98059=0.040）。IGF處理A431細胞，隨P-ERK蛋白表達的升高，P53蛋白的表達降低，經過Pearson相關性分析，P53與P-ERK的表達呈負相關（rIGF=-0.987，PIGF=0.010）。

圖2　IGF各激動劑組P53和P-ERK蛋白的表達

表5　不同濃度IGF對A431細胞P-ERK、P53蛋白表達的作用（±s）

表5　不同濃度IGF對A431細胞P-ERK、P53蛋白表達的作用（±s）

IGF　P-ERK/β-actin蛋白的表達　P53/β-actin蛋白的表達0 ng/ml　0.138±0.017　0.785±0.039 40 ng/ml　0.416±0.032覮　0.521±0.044覮F值　534.577　174.292 P值　0.000　0.000 80 ng/ml 120 ng/ml 0.641±0.029覮0.909±0.016覮0.328±0.029覮0.208±0.006覮

注：覮與對照組比較，P<0.05

3　討論

惡性腫瘤的發生、發展與諸多因素相關，而細胞凋亡能力的異常降低與增殖能力的異常增強是其中一個關鍵因素。MAPK/ERK信號轉導通路是將細胞表面信號轉導至細胞核的重要傳遞者，在多數細胞的增生和程序化死亡的調節中具有重要意義。

本研究應用MAPK/ERK信號轉導通路激動劑IGF作用于皮膚鱗癌A431細胞，P-ERK蛋白的表達升高，隨IGF濃度的升高，P-ERK蛋白升高的更加明顯，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P< 0.05）；而使用MAPK/ERK信號轉導通路抑制劑PD98059作用于A431細胞，P-ERK蛋白的表達降低，隨著PD98059濃度的升高，P-ERK蛋白明顯降低，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。該結果驗證IGF、PD98059可以分別做為MAPK/ERK信號通路的激動劑、抑制劑用于后續的實驗。

本實驗應用不同濃度MAPK/ERK轉導通路激動劑IGF及抑制劑PD98059作用于皮膚鱗癌A431細胞中，采用噻唑藍及流式細胞術檢測細胞的增殖及凋亡情況，結果顯示，IGF促使MAPK/ERK傳導通路活化后，可使A431細胞增殖能力增強，凋亡能力降低，且隨著IGF濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率逐漸升高，凋亡率逐漸降低，呈濃度-效應和時間-效應關系；PD98059促使MAPK/ERK傳導通路抑制后，可使A431細胞增殖能力降低，凋亡能力增強，并且隨著PD98059濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率和凋亡率逐漸升增高，呈濃度-效應和時間-效應關系。該結果與其他研究者在其他腫瘤中的研究結果一致，即MAPK/ERK信號轉導通路的持續活化可使SCC細胞喪失凋亡和分化的能力，異常增殖，產生腫瘤，而抑制該通路的活化可以使SCC細胞增殖抑制，凋亡能力增強，抑制腫瘤生長。

由于許多腫瘤組織中可檢測到p-ERK表達水平的增高[7]，所以，目前在臨床惡性腫瘤的化療中，有許多藥物是通過抑制ERK的活化來抑制腫瘤的生長。如用全反式維甲酸（all-trans retinoic acid/ATRA）處理乳腺癌細胞系SKBR-3后，ERK的磷酸化水平降低，導致SKBR-3細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制SKBR-3乳腺癌細胞的生長[8]。又比如，Lin等[9]通過對人類結腸癌HT-29細胞系的研究發現，番茄紅素通過抑制P-ERK的活化從而抑制基質金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase，MMP-7）的表達及HT-29細胞侵襲。而Chang等[10]研究發現，Mesothelin蛋白在卵巢癌中高表達且與預后不良相關，Mesothelin可以通過活化MAPK/ERK通路，上調MMP-7的表達，從而增強卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。在體外實驗中，通過應用ERK1/2抑制劑可以抑制MMP-7的表達。在動物體內實驗中，小鼠應用MAPK/ERK抑制劑，可以減少腫瘤組織中MMP-7的表達，延緩腫瘤的生長，延長小鼠的生存期。所以Chang等[10]研究者認為，通過阻斷Mesothelin相關的MAPK/ERK信號途徑的轉導對于卵巢癌的治療具有重大意義。此外，MAPK/ERK通路抑制劑PD-0325901的一期藥代動力學及藥效學研究已應用于晚期癌癥患者[11]。

野生型p53作為一種經典的抑癌基因，通過下調抑凋亡因子Bcl-2，上調促凋亡因子Bax，使Bcl-2/Bax比值下降，降低線粒體的跨膜電位，從而激活凋亡執行因子caspase-3引起細胞凋亡。

本實驗Western blot檢測結果顯示，使用MAPK/ERK信號傳導通路激動劑IGF作用于A431細胞，P53蛋白的表達降低，隨著IGF濃度的升高，P53蛋白明顯降低，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；而使用MAPK/ERK信號傳導通路抑制劑PD98059作用于A431細胞，P53蛋白的表達升高，隨著PD98059濃度的升高，P53蛋白明顯升高，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。且在激動劑各組及抑制劑各組中P-ERK的表達與P53的表達呈負相關。Western blot檢測結果結合本實驗MTT及流式細胞術結果，筆者認為，在皮膚SCC中，P-ERK維持在一定的水平，當IGF使MAPK/ERK信號通路進一步活化后，促凋亡因子P53蛋白水平降低，誘導細胞分化和凋亡的功能受抑，細胞異常增殖，產生腫瘤；反之，當使用PD98059阻斷MAPK/ERK信號通路的活化，促凋亡因子P53蛋白水平增高，誘導細胞分化和凋亡，抑制腫瘤生長。

所以，明確皮膚SCC中MAPK/ERK信號通路與抑癌基因P53的相互作用機制，對于補充SCC的發生機制及治療策略具有重要意義。

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（王榮兵編輯）

MAPK/ERK regulation of P53 in human epidermoid carcinoma cell line A431

Yu-qin Hao1, Chun-yi Kang1, Xin Zhang2, Shu-xia Kang2, Xia Liu2
(1.Department of Dermatology, Baogang Hospital, Inner Mongolia Medical College, Baotou,
Inner Mongolia 014010, China; 2.Inner Mongolia Medical College, Hohhot, Inner Mongolia 010110, China)

Abstract:Objective To observe the impact of activation or inhibition of MAPK/ERK signaling pathway on the proliferation and apoptosis of human epidermoid carcinoma cell line A431 cells, and to investigate the interaction mechanism between MAPK/ERK signaling pathway and tumor suppression gene P53.Methods Human A431 cells were cultured and divided into MAPK/ERK inhibition groups of low-, medium- and highconcentration of inhibitor (PD98059 + DMSO), MAPK/ERK activation groups of low-, medium- and highconcentration of activator (IGF + PBS) and blank control group (DMSO).The in vitro cellular proliferation was detected by MTT assay, the cell apoptosis detected by flow cytometry (FCM) and the protein expression of p-ERK and p53 detected by Western blot in each group.Results The A431 cell proliferation was inhibited bybook=1,ebook=30different concentrations of inhibitor PD98059 with a clear concentration-effect and time-effect relationship (P< 0.05), and the cell proliferation was promoted in the different concentrations of IGF with a clear concentrationeffect and time-effect relationship (P< 0.05).The FCM result showed a significantly increased A431 cell apoptosis rate with increased PD98059 in a concentration-effect relationship(P < 0.05); while the apoptosis rate decreased significantly with increased IGF also in a concentration-effect relationship (P< 0.05).The Western blot results showed that after PD98059 treatment the protein expression of p-ERK was reduced and the protein expression of p53 was enhanced, additionally the change of both expressions became much bigger when the concentration of PD98059 increased further with significant differences (P< 0.05).For the A431 cells treated by IGF, the protein expression of p-ERK was enhanced and protein expression of p53 was reduced with increasing concentrations of IGF, for which the differences were significant (P< 0.05) compared with the control group.The protein expressions of p-ERK and p53 were negatively correlated by Pearson correlation analysis (P< 0.05).Conclusions The activation of MAPK/ERK signaling pathway by IGF in human epidermoid carcinoma cell line A431 cells could reduce the expression of apoptosis factor p53, enhance cell proliferation capacity and reduce apoptosis capacity, while the inhibition of MAPK/ERK signaling pathway results in the increased expression of p53, decreased cell proliferation and enhanced apoptosis.

Keywords:cutaneous squamous cell carcinoma; MAPK/ERK signaling pathway; p53

*基金項目：2013年內蒙古自治區衛生和計劃生育委員會醫療衛生科研計劃項目（No：201303116）；國家自然科學基金（No：81260407）

收稿日期：2015-08-14

文章編號：1005-8982（2016）01-0024-06

中圖分類號：R739.5

文獻標識碼：A