高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2基因的克隆表達及其單克隆抗體的制備方法

張建華

（烏蘭察布市動物疫病預防控制中心，內蒙古烏蘭察布 012000）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2基因的克隆表達及其單克隆抗體的制備方法

張建華

（烏蘭察布市動物疫病預防控制中心，內蒙古烏蘭察布 012000）

研制高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2基因的克隆表達及其特異性單克隆抗體（Mabs）的制備方法。本研究以HPPRRSV為研究對象，參照已發表的PRRSV基因組序列，設計一對PCR引物，并在其上下游分別添加BamHI和SalI酶切位點，獲得的PCR產物用BamHI和SalI酶切后與經同樣處理的pET-28a原核表達載體質粒連接，轉化DH5a感受態細胞后挑取陽性克隆，經酶切鑒定和測序驗證后，轉化至 E.coli BL21（DE3）中，經IPTG于37℃誘導表達不同時間點后，取細菌菌體用SDS-PAGE分析。結果表明，Nsp2在大腸桿菌中得到表達。經包涵體的提取，用豬抗PRRSV血清抗體進行Western-bolt鑒定，結果表明，融合表達的pET28adNsp2蛋白能被PRRSV陽性血清特異性識別。取純化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的劑量與等量弗氏完全佐劑進行乳化，并作為免疫原采取常規皮下多點注射免疫6-8周齡BALB/c小鼠。取其脾細胞與SP2/0的骨髓瘤細胞融合，經間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）篩選，采用有限稀釋法進行克隆。經過3次克隆后獲得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞，命名為A2F1。Western-blot和間接免疫熒光結果顯示這株單克隆抗體株能與Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株發生特異性反應，而不與PRRSV CH1A株發生反應，證明獲得的McAb為針對PRRSV JXA1株的McAb。抗體亞類鑒定結果表明，重鏈為IgG1型，輕鏈為κ鏈。采用間接ELISA法測得單抗的細胞培養上清抗體效價為1：800，腹水效價分別為1：12800。這株單抗的獲得為進一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立準確快速PRRSV的診斷方法提供了強有力的手段。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1株；Nsp2；單克隆抗體

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是1987年在美國首先爆發，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種新發性傳染病，主要導致母豬繁殖障礙、仔豬的大量死亡，是當前嚴重危害世界養豬業的病毒性傳染病之一[1]。自2006年開始，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HPPRRS）在我國的暴發與流行給養豬業帶來了巨大的經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）屬于尼多病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬成員，為不分節段的單股正鏈RNA病毒；其基因組全長約為15 kb，含9個開放式閱讀框（ORFs），其中ORF2-7編碼6種結構蛋白，ORF1編碼的聚合蛋白酶產生12個非結構蛋白（Nsp1-Nsp12）[2]。在PRRSV的非結構蛋白中，Nsp2基因的保守性最差。但Nsp2含有多個B細胞表位，且表位集中的區域親水性較強，具有較強的免疫原性，病毒感染后能夠刺激機體產生特異性抗體[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種、毒株、血清、細胞和實驗動物

pET-28a（+）原核表達載體；大腸桿菌DH5α、BL21 （DE3）；PRRSV JXA1株和CH1A株；抗PRRSV-NSP2的小鼠陽性血清；mark-145細胞、SP2/0骨髓瘤細胞；6～8周齡雌性BALB/c小鼠。

1.1.2 工具酶及主要試劑

各種限制性內切酶（Restriction endonuclease，RE）、T4 DNA連接酶、T4 DNA多聚酶、DNA Marker等工具酶。Taq DNA polymerase（PCR聚合酶）、dNTPs及DNA快速回收試劑盒。

新生小牛血清（超級）；RPMI-1640、DMEM、次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養基（HAT）、次黃嘌呤-胸苷培養基（HT）；弗氏完全和弗氏不完全佐劑、二甲基亞楓（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、聚乙二醇4000、HRP辣根過氧化物酶和FITC；單抗分型試劑盒；淋巴細胞分離液；羊抗鼠FITC標記熒光抗體；其他普通生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 Nsp2基因的克隆與表達

（1）引物設計與合成

從GeneBank獲得PRRSV Nsp2 蛋白的全基因序列，針對Nsp2基因片段設計一對引物，預期擴增的基因片段為2160bp，由試劑公司合成。

（2）目的片段的擴增

在PCR反應管中加入1μ LdNTPs（2.5mmol/L）、2μ L MgCl2、上下游引物

（3）原核表達質粒的構建與鑒定

BamHI和SalI雙酶切Nsp2并切膠回收目的基因片段，用同樣的酶切位點酶切pET28a原核表達載體并相連接。連接反應液轉化到DH5a感受態細胞，在LB固體培養基（Amp+）上37 ℃培養。在轉化的平皿中挑取一個單菌落接種于含相應抗生素的3 mlLB液體培養基，于37 ℃振蕩培養10～12 h，用試劑盒提取質粒并進行酶切鑒定。

（4）蛋白的原核表達、提取與鑒定

將空白載體和鑒定正確的重組質粒同時分別轉化BL 21 （DE3）感受態細胞，在轉化的平皿中挑取一個單菌落接種于含相應抗生素的3 mlLB液體培養基，于37℃振蕩培養10～12 h；4℃放置過夜。第二天，將培養物5000 r/min離心5 min，然后用新鮮LB洗滌1次后，用30 mL含相應抗生素的新鮮LB液體培養基重懸，于37 ℃振蕩培養1～2 h，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導培養3 h、4 h、5 h、6 h。取1 ml菌液收集于EP管中，5000 r/min離心5 min，棄上清，加100μ l ddH20吹散混勻，加100μ l 2xSDS凝膠加樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，于12%的SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達在不同時間的表達。

取誘導表達3 h的細菌培養物8000 r/min離心10 min，收集細菌，用10 mM TE（pH 8.0）洗一次，除去殘留培養基成分，再用buffer A重懸，凍融兩次或加入適量的溶菌酶，置37℃溫浴1 h后，加DTT與Triton X-100至終濃度分別達5 mM與1%，然后進行高頻短時超聲波處理數次，l0 sec/次（冰上操作），直到液體變為透明。后4℃，100000 r/min離心15 min，分別收集上清與沉淀，取樣進行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白是以可溶形式還是以包涵體形式存在。剩余樣品置-20 ℃備用。

依據SDS-PAGE結果，將重組蛋白所在的包涵體溶解于含20% SKL（十二烷基肌氨酸鈉）的PBS（pH 7.2）中，室溫靜置30 min～2 h。用紫外分光光度計測出溶解的蛋白質濃度，用PBS稀釋至1 mg/mL，裝入透析袋，內加終濃度為0.2%的PEG4000與1 mM氧化型；還原型谷胱甘肽（摩爾比例為1：4）幫助變性的肽鍵依天然構象復性，用大于20倍體積的PBS進行4 ℃攪拌透析復性，每4 h換液一次，換液6次后收集蛋白液，過濾除菌后分裝置-80℃保存。再經Western blot鑒定表達蛋白的活性。

1.2.2 動物免疫

表達蛋白用PBS緩沖液稀釋到300 μ g/ml，與弗氏完全佐劑等體積充分混勻乳化，選擇雌性6周齡BALB/c小鼠5只，頸背部皮下多點注射0.2 ml。第14 d時加強免疫1次（佐劑改用弗氏不完全佐劑，免疫劑量和部位同首次免疫）。在第24 d時尾靜脈采血，分離血清，用間接ELISA法檢測抗體水平，在第44 d時對免疫效果最好的BALB/c小鼠使用不加佐劑的表達蛋白0.2 ml尾靜脈注射加強免疫一次，3 d后即可融合。

1.2.3 間接ELISA檢測方法的建立

用純化后的蛋白作為抗原包被酶標板，同時設PGEX-KG表達產物作為對照，按常規間接ELISA操作步驟，采用方陣法確定抗原最佳包被濃度，陰、陽性血清最佳稀釋度及判定標準。

1.2.4 雜交瘤細胞的融合、篩選、克隆和腹水制備

取免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞，按5：1的比例在PEG4000的作用下融合，將融合后的細胞低速離心后棄上清，用10 mL37 ℃預溫含HAT的1640培養液重懸，加入事先加有90 ml飼養細胞懸液的100 mL鹽水瓶中，混合均勻后滴加到96孔細胞培養板，每孔200μ l。置5%CO2培養箱中37 ℃培養。融合后第3～4d用含HAT1640培養液半量換液。待細胞生長到占孔底1/3時，取上清用間接ELISA試驗方法進行篩選。選取PCV2-ORF2反應陽性而PGEX-KG反應陰性且細胞生長旺盛形態好的孔，用有限稀釋法進行克隆。對抗體陽性孔采用有限稀釋法克隆3次后，擴大培養收集上清，取約1×106雜交瘤細胞腹腔注入預先注射不完全佐劑7d 的6～8周齡BALB/c小鼠制備腹水。7～10 d后，無菌采集腹水，離心，經檢測后分裝，置-20℃凍存備用。陽性雜交細胞瘤擴大培養后，加入細胞凍存液保存在液氮中。

1.2.5 特異性鑒定

（1）Western-blot鑒定

PRRSV-NSP2重組蛋白經SDS-PAGE電泳后，將凝膠中的重組蛋白轉至硝酸纖維素膜上。以小鼠腹水為一抗，HRP羊抗鼠IgG為二抗，進行Western-blot鑒定。同時用抗PRRSV-NSP2的小鼠陽性血清作為陽性對照。

（2）間接免疫熒光試驗

分別用用PRRSV J X A1、CH1A株感染24孔培養板中的MARK-145細胞，培養24 h后用300mmolD-氨基葡萄糖處理30 min，然后用PBS洗三次，再培養48 h后收獲細胞棄上清，用PBS洗三次再用甲醇固定細胞，室溫放置10 min，用PBS洗三次，再用10%牛血清封閉，37℃，30 min。用PBS洗三次加入小鼠腹水（1：100稀釋），37℃，60 min，PBS洗三次，加入異硫氰酸熒光素（Fluorescein isocyanate，FITC）標記的羊抗鼠IgG（1：200稀釋）37 ℃孵育30 min，用PBS洗三次置熒光顯微鏡下觀察。同時設不接毒的正常細胞對照。用免疫鼠和空白鼠血清分別做為陽性和陰性對照。有綠色熒光者判為陽性，無熒光者判為陰性。

1.2.6 雜交瘤細胞株的特性鑒定

（1）單抗的亞類鑒定

依據Thermo公司產品說明書操作，采用間接ELISA法鑒定。

（2）單克隆抗體效價測定

采用間接ELISA方法測定。將單克隆抗體上清以及腹水倍比稀釋后，分別以SP2/0細胞培養上清和SP2/0腹水為陰性對照，以P/ N ≥2.1時的最高稀釋倍數為效價判定終點。

2 結果

2.1 Nsp2 基因的克隆與表達

原核表達質粒的鑒定結果：

圖1 pet28a-nsp2的酶切鑒定結果

圖5 pET28a-Nsp2表達產物的純化

2.2 間接ELISA 方法的建立

以pET28a-Nsp2蛋白為ELISA抗原，分別與小鼠標準陽性血清和標準陰性血清進行方陣滴定，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數。方陣滴定結果方陣滴定結果顯示：血清的最佳稀釋倍數為1：800，可溶性蛋白的最佳稀釋度為1：800（蛋白含量為1875ng/ml）。用于單克隆抗體篩選之用的羊抗鼠IgG酶標抗體工作濃度為1：5000。

2.3 雜交瘤細胞株的建立

經純化NSP2蛋白免疫的BABL/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0經PEG4000融合后，通過間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，獲得1株陽性雜交瘤細胞。命名為A2F1，這株雜交瘤細胞經過3次亞克隆后，100%的檢測孔保持了分泌抗pET28a-Nsp2蛋白抗體的能力。

2.4 單抗的特異性鑒定

2.4.1 單抗的亞型鑒定

采用抗體檢測試劑盒測定McAb亞型，鑒定其抗體蛋白亞型。鑒定結果表明，重鏈為IgG1型，輕鏈為κ鏈。

2.4.2 單抗效價的測定

采用間接ELISA法測得單抗的細胞培養上清抗體效價為1：800，腹水效價分別為1：12800。

2.4.3 Western blot鑒定

Western blot 分析表明，A2F1單抗與pET-Nsp2 蛋白在預期位置83kDa處有特異性反應條帶出現，而與pET28a 對照未見反應條帶。

2.4.4 間接免疫熒光法鑒定單克隆抗體的特異性結果

A2F1可以和PRRSV（JXA1株）Marc-145細胞發生特異性反應，A2F1不能與PRRSV（CH1A株）Marc-145細胞發生特異性反應。

3 討論

Nsp2 蛋白是一種非結構蛋白，是病毒在復制的過程中產生的一種RNA復制酶，在完整的病毒粒子中不存在，因此用PRRSV全病毒免疫小鼠不能使小鼠產生針對nsp2蛋白的抗體。首先，Nsp2是一個復合功能蛋白，具有 3C 樣半胱氨酸蛋白酶活性，且這一區域具有順式以及反式切割活性[4]。其次Nsp2 是PRRSV基因組中變異最大的一個基因，且變異主要集中在中部區域[4]。由于HPPRRSV（JXA1）nsp2 基因較大，表達整個基因組比較困難，所以王海燕等[4]，武佳斌等[5]以及Yan等[6]只是選擇性的表達了免疫原性較強的一小段基因。而本實驗通過截去NSP2基因 C 端跨膜區的疏水序列，在沒有破壞nsp2表位序列以及不影響其免疫原性的情況下。設計引物擴增序列，利用表達效率較高的原核表達系統pET-28a，成功構建了重組質粒并進行了原核表達。用豬抗PRRSV血清抗體進行Western-bolt 鑒定，結果表明，融合表達的pET28adnsp2蛋白能被 PRRSV 陽性血清特異性識別。

在單克隆抗體制備過程中，抗原的純度是制備特異性單克隆抗體的技術關鍵，用純度低的抗原不僅給篩選針對目的抗原的單抗帶來麻煩，也會影響抗體的產生[5]。在實驗初期通過低溫誘導可以使蛋白以可溶性方式表達，但是在過鎳柱純化的過程中蛋白的得率以及純度都不理想只能通過提包涵體的方法提高它的純度與得率，從而降低了非特異性的產生減少了工作量。Li[7]等將我國最新分離的 PRRSV JXA1和SY0608株與美洲標準毒株 VR2332 進行比較，發現 NSP2 基因有30aa缺失，同樣與在我國流行的PRRS毒株CH1A相比也有30aa缺失，而Zhou，L[8]等發現缺失的30aa與毒株的毒力并沒有太大的相關性。特異性試驗表明，本試驗獲得的Mabs與NSP2蛋白有特異性反應，說明獲得的Mab具有高度的特異性，而與標準美洲型毒株CH1A不反應，說明這這株單抗針對 JXA1株 Nsp2 基因中的非保守區域，能夠區分標準美洲型毒株CH1A和目前流行的高致病性 PRRSV 強毒株，這為建立豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染特異、敏感和快速的檢測方法及N sp2基因的功能研究奠定了基礎。

[1] 孫慶申，仇華吉，童光志，等.豬繁殖與呼吸綜合征單克隆抗體研究進展[J].動物醫學進展，2005，22（4）：25-28.

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[3] O leksiewicz M B，Botner A，Toft P，et al. Epitope mapping porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display：the nsp2 fragment of the replicase polyprotein contains a cluster of B-Cell epitopes[J]. J Virol，2001，75（7）：3277-3290.

[4] Han J，Rutherford MS，Faaberg KS，et al. The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus nsp2 Cysteine Protease Domain Possesses both trans- and cis-Cleavage Activities[J]. Journal of Virology，2009，83（18）：9449-9463.

[5] 王海燕.豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白Nsp2原核表達與單克隆抗體的研制[D].農業大學，2008.

[6] 武佳斌.HP-PRRSV（HuN4）截斷Nsp2蛋白的原核表達及其單克隆抗體的制備[D].東北農業大學，2009.

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