LDN-193189對人去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1的抑制作用研究*

楊康　湯小東　郭衛

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LDN-193189對人去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1的抑制作用研究*

楊康湯小東郭衛

摘要目的：檢測骨形成蛋白（BMP）受體抑制劑LDN-193189對人去分化軟骨肉瘤（DDCS）細胞系NDCS-1的抑制作用，探討LDN-193189對去分化軟骨肉瘤的抑癌機制。方法：以5 nmol/L的LDN-193189作用于NDCS-1細胞，MTT、平板克隆法檢測LDN-193189對NDCS-1細胞的增殖抑制作用，Transwell法、劃痕實驗檢測LDN-193189對NDCS-1細胞的侵襲抑制作用，Western blot檢測BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2的蛋白表達抑制情況。結果：藥物處理后NDCS-1細胞增殖、侵襲被明顯抑制；藥物處理后NDCS-1細胞的BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2蛋白表達下降。結論：LDN-193189通過抑制BMPR2-p-Smad1/5-RUNX2信號傳導通路能有效抑制去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1的增殖侵襲能力。

關鍵詞去分化軟骨肉瘤LDN-193189 NDCS-1 BMPR2 p-Smad1/5 RUNX2

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81172544）和教育部新世紀人才項目（編號：NCET-12-0007）資助

LDN-193189inhibits progression and induces apoptosis in human dedifferentiated chondrosarcoma cell line NDCS-1

Kang YANG, Xiaodong TANG, Wei GUO
Correspondence to: Xiaodong TANG; E-mail: tang15877@126.com
Department of Bone Oncology, Peking University, People's Hospital, Beijing 100044, China
This work was supported by the Natural Science Foundation of China（No.81172544）and the Program for New Century Excellent Talents in University（No.NCET-12-0007）

Abstract Objective: To clarify the effects of the BMP receptor inhibitor LDN-193189 in the dedifferentiated chondrosarcoma（DDCS）cell line NDCS-1 and to explore the anti-tumor mechanismof LDN-193189 in DDCS.Methods: NDCS-1 was treated with 5 nmol/L of LDN-193189.MTT assay and clone formation experiments were used to verify that LDN-193189 suppressed cell proliferation.Transwell and wound healing tests were performed to demonstrate that LDN-193189 inhibited cell invasion.Western blot detection was used to show that LDN-193189 inhibited the suppression of BMPR2, p-Smad1/5, and RUNX2 protein expression.Results: The BMPR2 signaling pathway was inhibited by LDN-193189; thus, cell viability and invasion were significantly suppressed.Conclusion: LDN-193189 induces the inhibition of progression in vitro via the BMPR2-p-Smad1/5-RUNX2 signaling pathway in the human DDCS cell line NDCS-1.

Keywords:dedifferentiated chondrosarcoma, LDN-193189, NDCS-1, BMPR2, p-Smad1/5, RUNX2

去分化軟骨肉瘤是一種特殊的軟骨肉瘤，約占所有軟骨肉瘤的10%［1］，軟骨肉瘤一旦發生去分化改變，腫瘤侵襲性明顯增高［2］。由于早期轉移與放化療不敏感，去分化軟骨肉瘤預后極差，5年生存率為10%～24%［3-5］。以往實驗室研究表明去分化軟骨肉瘤中BMPR2、RUNX2表達明顯高于普通軟骨肉瘤［6-7］，抑制BMPR2能夠控制腫瘤的發生發展［8］，而LDN-193189是BMP受體特異性抑制劑，因此本研究以去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1為研究對象，觀察LDN-193189對NDCS-1細胞的作用并檢測BMPR2及下游基因p-Smad1/5、RUNX2的表達，探討LDN-193189對NDCS-1細胞的作用機制，為后續體內實驗與臨床應用提供前期研究基礎。

1　材料與方法

1.1材料

人去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1由日本Akira Ogose教授惠贈；人Ⅱ級軟骨肉瘤細胞系SW1353（美國ATCC公司）；人Ⅰ級軟骨肉瘤細胞系HCS2/8由日本Takigawa教授惠贈；RPMI-1640、L-15、DMEM培養基（美國Gibco公司）；細胞胎牛血清（美國Gibco，Invitrogen公司）；LDN-193189購自美國Selleck公司，用100%DMSO溶解；MTT購自美國SIGMA公司；Transwell小室購自美國Corning公司；雙抗購自美國Gibco公司。小鼠抗人多克隆BMPR2抗體購自英國Abcam公司；小鼠抗人多克隆RUNX2、兔抗人多克隆GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；p-Smad1/5、Smad1購自德國CST公司；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG、免疫組織化學染色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養NDCS-1與HCS2/8培養于含有5% CO2的37℃培養箱，SW1353培養于不含CO2的37℃培養箱。培養基分別為RPMI-1640、DMEM、L-15培養基，所有培養基均含10%胎牛血清及1%雙抗，取對數生長期細胞用于實驗操作。

1.2.2免疫組織化學染色對病理證實為去分化軟骨肉瘤的蠟塊進行切片，按照免疫組織化學染色試劑盒說明書操作：脫蠟，PBS清洗，抗原修復，3% H2O2孵育，封閉，BMPR2、RUNX2一抗37℃孵育3 h，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色。

1.2.3MTT法檢測LDN-193189對NDCS-1細胞的增殖抑制作用取對數生長期NDCS-1細胞計數，以5000個細胞/孔的密度接種于96孔板，24 h后按照2.5、5、10、20 nmol/L濃度加入LDN-193189，設置5個復孔并以DMSO作對照。加藥后培養48 h，每孔加入MTT （5 mg/mL）20 μL，繼續培養4 h，吸去培養液，每孔加入DMSO150μL，酶標儀（波長570nm）測定每孔OD值。

1.2.4平板克隆法檢測LDN-193189對NDCS-1細胞集落形成能力的影響取對數生長期NDCS-1細胞計數，按1 000個細胞/孔密度接種于6孔板，加入5 nmol/L的LDN-193189，設置3個復孔并以DMSO作對照。14 d后吸去培養液，每孔加入1 mL結晶紫培養30 min，觀察并拍照。

1.2.5Transwell法檢測LDN-193189對NDCS-1的遷移抑制作用取對數生長期NDCS-1細胞計數，按5×105/孔密度接種于Transwell小室上室，下室加入5 nmol/L的 LDN-193189，設置3個復孔并以DMSO作對照。加藥后培養24 h，吸去培養液，0.1%結晶紫染色計數。

1.2.6劃痕實驗檢測LDN-193189對NDCS-1的遷移抑制作用取對數生長期NDCS-1細胞接種于6孔板，待細胞匯合度達到80%時于6孔板劃一直線，加入5nmol/L 的LDN-193189，DMSO作對照，于0、24 h拍照。

1.2.7Western blot檢測BMPR2、p-Smad1/5、Smad1、RUNX2表達取對數生長期NDCS-1細胞接種于6孔板，待細胞匯合度達到80%時加入5 nmol/L的LDN-193189，DMSO作對照，藥物作用48 h收集細胞，用RIPA+ 1%PMSF裂解液裂解細胞提取總蛋白，進行10% SDSPAGE分離電泳，濕轉法轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃培育過夜、次日二抗室溫孵育1 h，化學發光試劑盒顯色。所有抗體濃度均為1:1 000。

1.3統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析，均數比較采用單因素方差分析和獨立t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1BMPR2、RUNX2在不同級別軟骨肉瘤中差異表達

免疫組織化學染色結果顯示在去分化軟骨肉瘤中BMPR2與RUNX2陽性表達，表達陽性率統計結果見表1，BMPR2、RUNX2在去分化軟骨肉瘤中表達陽性率明顯高于普通軟骨肉瘤，有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。在去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1中BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2的蛋白表達水平明顯高于普通軟骨肉瘤細胞系SW1353及HCS2/8（圖1，2）。

表1　臨床病理等級與BMPR2或RUNX2表達陽性之間的關系Table 1 Association between clinicopathological characteristics and BMPR2 or RUNX2 expression

圖1　去分化軟骨肉瘤樣本中BMPR2、RUNX2表達（免疫組織化學染色×200）Figure 1 Detection of BMPR2 and RUNX2 expression in DDCS samples with immunohistochemistry（immunohistochemistry×200）

圖2　不同級別軟骨肉瘤細胞系中BMPR2、p-Smad1/5、RUNX2蛋白表達Figure 2 Detection of BMPR2, p-Smad1/5, and RUNX2 protein levels in different grades of chondrosarcoma cell lines with Western blot analysis

2.2 LDN-193189對去分化軟骨肉瘤NDCS-1細胞增殖影響

MTT結果顯示，LDN-193189能有效抑制去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1細胞的增殖：2.5 nM增加到5 nM時細胞增殖能力顯著降低，而5nM以上隨著濃度的增加未見更加明顯的抑制細胞增殖能力，因此后續實驗均以5 nM為實驗濃度。克隆形成實驗表明5 nM的LDN-193189明顯抑制NDCS-1細胞的集落形成能力（圖3）。

圖3　LDN-193189處理細胞24 h后能明顯抑制去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1的增殖能力Figure 3 LDN-193189 significantly inhibits proliferation of the DDCS cell line NDCS-1 after 24 h of treatment

2.3LDN-193189能明顯抑制去分化軟骨肉瘤NDCS-1細胞的侵襲能力

Transwell結果顯示，LDN-193189能明顯抑制去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1侵襲能力，劃痕實驗表明用藥處理24 h后，能明顯抑制NDCS-1的遷移能力（圖4）。

圖4　LDN-193189處理細胞24h后能明顯抑制去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1的侵襲能力Figure 4 LDN-193189 significantly inhibits the invasive capacity of the DDCS cell line NDCS-1 after 24 h of treatment

2.4LDN-193189抑制BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2的表達

經過5 nM LDN-193189處理后，與對照組相比，NDCS-1中Smad1蛋白表達水平無改變，而BMPR2、p-Smad1/5、RUNX2蛋白表達水平顯著降低（圖5）。

圖5　Western blot結果顯示LDN-193189抑制NDCS-1細胞中BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2蛋白表達水平Figure 5 LDN-193189 down-regulates BMPR2, p-Smad1/5, and RUNX2 protein levels in the DDCS cell line NDCS-1

3　討論

去分化軟骨肉瘤是一種高度惡性的骨腫瘤，放化療不敏感，術后極易轉移復發，目前多采用手術切除［3-5］。去分化軟骨肉瘤常由軟骨肉瘤發生去分化改變形成，預后極差，多數患者發病2年內死于廣泛轉移［2］。

LDN-193189是合成的一種小分子化合物，能夠選擇性抑制BMP信號通路，通過抑制BMPⅠ型受體ALK2和ALK3的轉錄活性，進而抑制下游Smad1/5/8磷酸化及轉錄因子的表達，但是研究發現LDN-193189同樣能夠抑制BMPR2蛋白水平的表達。

本實驗研究了LDN-193189對去分化軟骨肉瘤細胞系NDCS-1的抑制增殖侵襲作用。MTT結果顯示，LDN-193189有效抑制NDCS-1細胞的增殖能力并呈現劑量依賴效應；同時使用克隆形成實驗，發現經過LDN-193189處理后，NDCS-1細胞集落形成能力明顯降低。之后使用Transwell實驗及劃痕實驗，發現LDN-193189可以明顯抑制NDCS-1細胞的侵襲能力。

BMP是TGF-β超家族成員，其在調控生長發育過程中起著重要作用，如增殖、分化、遷移、細胞死亡等［9］。目前已發現將近20種BMP家族成員［10］，BMP信號通路由細胞膜表面的BMP配體結合到BMPⅠ型和Ⅱ型受體所啟動［9］。配體誘導的受體活化能夠啟動兩條信號通路：第一種是依賴Smad信號通路，即受體特異性的磷酸化Smad1/5/8，之后磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復合體，最終這一復合體進入核內并調控目的基因轉錄［11］。另一條信號通路是非依賴Smad信號通路，即有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），包含p38、Jun激酶和ERK激酶信號通路［12-13］。BMPR2是BMP受體的一種，在BMP信號通路中起著重要作用，BMPR2的異常導致肺動脈高壓的發生［14］。此外，多種惡性腫瘤中BMPR2常異常表達，如乳腺癌［8］。以往的研究認為BMPR2是腫瘤抑制基因，能夠抑制腫瘤的轉移與復發［15］，但本課題組以往研究卻發現BMPR2在軟骨肉瘤中起著促進腫瘤轉移與復發的作用［16］。此外，在前期應用免疫組織化學實驗發現BMPR2及下游基因RUNX2在去分化軟骨肉瘤中高表達。而LDN-193189是BMP受體抑制劑，也許能通過抑制BMPR2及下游基因從而抑制去分化軟骨肉瘤的發生發展。在本研究中，經LDN-193189處理后，NDCS-1細胞中BMPR2、p-Smad1/5、RUNX2表達明顯降低，而Smad1蛋白的表達無明顯變化。結果表明，LDN-193189通過下調BMPR2-pSmad1/5-RUNX2信號通路有效抑制NDCS-1細胞的增殖侵襲并促進凋亡。但本研究的重點是BMPR2依賴Smad通路，是否LDN-193189也能通過非依賴Smad信號通路調控腫瘤的發生發展尚需進一步研究證實。

綜上所述，LDN-193189作為一種實驗藥物，在體外可以有效抑制去分化軟骨肉瘤細胞系的增殖侵襲能力。本實驗為將來LDN-193189作為治療去分化軟骨肉瘤一種靶向藥物奠定前期研究基礎。

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（2015-11-17收稿）

（2016-01-06修回）

（編輯：楊紅欣）

楊康專業方向為骨腫瘤的臨床診治與基礎研究。

E-mail：yzykchina@163.com

·臨床研究與應用·

作者簡介

通信作者：湯小東tang15877@126.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.02.293

作者單位：北京大學人民醫院骨腫瘤科（北京市100044）