福建泰寧野生鐵皮石斛ISSR親緣關系分析

江金蘭，葉 煒*，李永清，范志敏，雷伏貴(.三明市農業科學研究院藥用植物研究所,福建沙縣 365509; .福建泰寧紅石山生態農業科技有限公司,福建泰寧 354400)

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福建泰寧野生鐵皮石斛ISSR親緣關系分析

江金蘭1，葉 煒1*，李永清1，范志敏2，雷伏貴1
(1.三明市農業科學研究院藥用植物研究所,福建沙縣 365509; 2.福建泰寧紅石山生態農業科技有限公司,福建泰寧 354400)

摘 要：利用ISSR分子標記技術對158份福建省泰寧縣野生鐵皮石斛(Dendrobium officinale)單株進行親緣關系分析。結果顯示,11條ISSR引物在158份樣本中共擴增條帶189條,多態性比率達91.7%,表明泰寧野生鐵皮石斛樣本間存在極為豐富的遺傳多樣性; UPGMA樹狀圖分析顯示,樣本總體遺傳距離介于0～0.58,在遺傳距離0.43處,158份福建省泰寧野生鐵皮石斛樣本被分為4個類群,具有較高的物種多樣性。

關鍵詞：鐵皮石斛;親緣關系; ISSR;遺傳多樣性

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160221

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物,生于海拔1 600 m的山地半陰濕的巖石上,喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環境。鐵皮石斛主要產于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部等地［1］。因生長周期緩慢,野生鐵皮石斛極難存活,已被列入重點保護的珍稀瀕危藥用植物。鐵皮石斛因表皮鐵綠色而得名,具有獨特的藥用價值,以其莖入藥,屬補益藥中的補陰藥,《中國藥典》指其具有益胃生津、滋陰清熱的功效［2］,現代醫學指其擁有增強免疫功能、降低血糖血脂、抗腫瘤、滋養肌膚、抗衰老等功效。

福建省地處東南沿海,為南亞、中亞熱帶氣候區的交疊地帶,境內武夷山、戴云山兩大山脈的屏障及臺灣海峽暖流作用,形成地形復雜、雨量充沛的地理環境,為石斛屬植物的生長提供了極佳的生境［3］。泰寧縣位于武夷山脈中段的杉嶺支脈東南側,海拔落差大,境內大量丹霞地貌以丘陵及山地形式分布,蘊藏有豐富的野生鐵皮石斛資源,并在外觀上與現有鐵皮石斛栽培品種呈現豐富的多樣性。DNA分子標記技術作為傳統分類的補充,可減少由于形態描述和環境條件產生的誤差,從分子水平鑒定個體和群體間的差異; DNA分子標記技術在石斛上的應用主要集中在遺傳穩定性［4-6］、種間鑒定［7-11］以及野生居群分析［12-19］等方面。本研究以福建省泰寧縣采集的158份野生鐵皮石斛單株為試驗材料,利用ISSR分子標記技術對其遺傳多樣性及親緣關系進行分析,了解福建泰寧野生鐵皮石斛的生物多樣性,對該地區野生鐵皮石斛資源的保護和利用具有重要的理論和現實意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料

本試驗所用的材料為從福建泰寧采集的野生鐵皮石斛單株158份(部分樣本如圖1),由福建泰寧紅石山生態農業科技有限公司提供。

1.1.2生化試劑

Taq酶和Marker購自上海寶生物工程有限公司,瓊脂糖、SDS、ISSR引物購自上海生工生物工程技術服務公司。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采用改良CTAB小量法提取鐵皮石斛葉片的總DNA。具體步驟為:取幼嫩葉片0.1 g,加液氮研磨至粉末狀,轉移至2 mL離心管中;加800 μL 70℃預熱的提取緩沖液,振蕩混勻,于70℃水浴鍋溫浴5～10 min,期間不時輕搖;加入400 μL氯仿,顛倒混勻3～5 min; 12 000 g,4℃離心5 min,棄上清,用75%預冷的乙醇漂洗2次;晾干,加入50 μL ddH2O,常溫下溶解; -20℃中保存備用。1.2.2 ISSR引物篩選及擴增

圖1　福建泰寧野生鐵皮石斛的部分單株

隨機抽取3個鐵皮石斛樣本混合,對100條隨機ISSR引物進行初步篩選,篩選出清晰、重復性好的ISSR引物,再用所有鐵皮石斛的DNA樣本進行進一步篩選,最終篩選出條帶豐富、清晰的ISSR引物11條作為正式擴增的引物(表1)。

ISSR-PCR擴增反應體系20 μL:ddH2O 9 μL,2×Taq MasterMix 9 μL,引物1 μL,模板DNA 1 μL。ISSR-PCR擴增程序:94℃預變性4 min,94℃變性45 s,不同退火溫度下退火45 s,72℃延伸2 min,40個循環,72℃延伸10 min,4℃保存PCR產物。2%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增電泳產物,EB染色,凝膠成像系統觀察結果并拍照記錄。

1.3數據統計與分析

1.3.1數據統計

ISSR擴增產物經成像儀拍照,同一引物擴增、電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性,利用人工方法進行統計,將擴增產物在相同遷移位置清晰的條帶賦值為1,沒有或不易分辨的條帶賦值為0,用Excel建立原始數據矩陣。

1.3.2數據分析

數據采用DPS 7.05軟件進行聚類分析,生成UPGMA (un-weighted pair group method with arithmetic mean)聚類圖。

2　結果與分析

2.1ISSR標記擴增結果

從100條ISSR引物中篩選出11條條帶豐富清晰的ISSR引物(表1),利用這些引物對158份福建泰寧野生鐵皮石斛單株進行ISSR-PCR擴增。結果(圖2)表明,11條引物共擴增條帶189條,多態性比率達91.7%,單條引物擴增的多態性條帶數在12～22,平均17.2條,其中擴增出最多條帶的引物是I73,共擴增出條帶22條,ISSR擴增產物的分子量大多在100～2 500 bp。

表1　ISSR分子標記引物

2.2福建泰寧野生鐵皮石斛樣本聚類分析

PCR擴增結果采用Excel按0和1記錄后,使用DPS 7.05軟件分析其遺傳距離,得到UPGMA親緣關系的樹狀圖(圖3)。結果表明,樣本間遺傳距離介于0～0.58;在遺傳距離0.43處,158份福建省泰寧野生鐵皮石斛樣本被分為4個類群,第Ⅰ類群為樣本41,54,113號,第Ⅱ類群為135,151號,第Ⅲ類群為64,153號,第Ⅳ類群為其余151份樣本,其中,僅4號和52號、139號和161號、115號和121號、207和215號、208和212號、46和81號之間的遺傳距離較近,其余樣本間呈現較大的遺傳距離。

圖2　ISSR引物I73 PCR擴增圖譜

圖3　福建泰寧野生鐵皮石斛樣本的UPGMA聚類分析樹

3　討論

福建省是鐵皮石斛的原產地之一［2］,據林建麗［3］對福建省野生石斛屬植物分布及生境調查研究發現,鐵皮石斛多分布在邵武、寧化、泰寧、建寧、將樂等地。雖然泰寧縣野生鐵皮石斛的民間采集與利用歷史悠久,但對該地區的鐵皮石斛的種質資源多樣性的調查與分析還未見報道。丁鴿等［17-18］利用RAPD和SRAP標記技術對不同居群鐵皮石斛的遺傳多樣性進行評價,結果表明鐵皮石斛種內多態性水平較高,可達91.35% (RAPD)和88.01% (SRAP);包英華等［19］利用SRAP技術分析8個居群鐵皮石斛的遺傳多樣性,結果表明鐵皮石斛種質資源遺傳多樣性水平較高,總多態性條帶比率為96.46%。本試驗以源自福建省泰寧縣158份野生鐵皮石斛單株為材料,利用ISSR分子標記技術,從100條引物中篩選出11條條帶豐富清晰的ISSR引物,利用這些引物對158份福建泰寧野生鐵皮石斛單株進行ISSR-PCR擴增,共擴增條帶189條,多態性比率達91.7%,該結果與前人的研究結果基本一致。

從聚類分析的結果看,源自福建泰寧的158份野生鐵皮石斛樣本間遺傳距離介于0～0.58之間,在遺傳距離0.43處,158份福建省泰寧野生鐵皮石斛樣本被分為4個類群,表明雖然泰寧野生鐵皮石斛各樣本源自同一地區,但是各樣本間呈現較為復雜的遺傳結構。本研究結果表明,泰寧野生鐵皮

石斛種群具有豐富的遺傳多樣性,但由于近年來破壞性采集,野生資源急劇減少,對本地區野生鐵皮石斛進一步的研究和保護具有重要的現實意義。

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(責任編輯：張 韻)

通信作者:葉 煒(1980—),男,副研究員,博士,主要從事園藝植物生物技術研究工作,E-mail:yewei922@qq.com。

作者簡介:江金蘭(1973—),女,福建泰寧人,高級農藝師,主要從事園藝植物生物技術研究工作,E-mail:420465520@qq.com。

基金項目:國家級星火計劃項目(2014GA720032);福建省種業創新與產業化工程項目(FJZZZX-1540);福建省三明市科技計劃項目(2014-N-3);三明市農業科學研究院院立項目(2013-Y-01)

收稿日期:2015-09-15

中圖分類號：S567

文獻標志碼：A

文章編號：0528-9017(2016)02-0208-03

文獻著錄格式:江金蘭,葉煒,李永清,等.福建泰寧野生鐵皮石斛ISSR親緣關系分析［J］.浙江農業科學,2016,57 (2):208-210,213.