代謝調(diào)節(jié)劑對三孢布拉氏霉菌發(fā)酵的影響

閆　興， 向夢雄， 王常高，杜　馨， 林建國， 蔡　俊

(1 湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室， 湖北 武漢 430068；

2 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430068)

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代謝調(diào)節(jié)劑對三孢布拉氏霉菌發(fā)酵的影響

閆興1,2， 向夢雄1,2， 王常高1,2，杜馨1,2， 林建國1,2， 蔡俊1,2

(1 湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室， 湖北 武漢 430068；

2 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430068)

[摘要]三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素仍存在產(chǎn)物含量低、代謝調(diào)控方法單一等問題。為了進一步提高三孢布拉氏霉菌菌絲體中β-胡蘿卜素的含量，通過向初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的代謝調(diào)節(jié)劑，探究其對三孢布拉氏霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%的丙酮酸鈉、0.1%的Span-20、0.1%的2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、3%的甘油均能提高β-胡蘿卜素含量，其中抗氧化劑BHT的促進作用最大，β-胡蘿卜素含量達到4.25 mg/g，相比空白組提高了72.1%。不同濃度的液體石蠟對β-胡蘿卜素含量沒有促進作用，但其促進生物量的增大,使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量得到提升。

[關(guān)鍵詞]代謝調(diào)節(jié)劑； 三孢布拉氏霉菌； β-胡蘿卜素

β-胡蘿卜素(β-carotene)是一種天然的類胡蘿卜素，其含有2個β-紫羅酮環(huán)和4個異戊二烯側(cè)鏈，分子式為C40H56[1]。理論上1分子β-胡蘿卜素可轉(zhuǎn)化為2分子維生素A，故稱為維生素A原，其具有抗氧化、抗癌、免疫等多種生物活性，主要應用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥、飼料以及化工等領(lǐng)域[2-3]。目前，β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、天然提取法、生物合成法[4]。其中生物合成法由于不受環(huán)境因素以及原料、產(chǎn)地等的限制而受到廣泛關(guān)注[5]。三孢布拉氏霉菌是β-胡蘿卜素工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株，具有生物量大、單位菌體β-胡蘿卜素含量高等優(yōu)點[6]。但在工業(yè)化生產(chǎn)過程中仍存在著諸多問題，三孢布拉氏霉菌在液體培養(yǎng)基中易于結(jié)團，導致發(fā)酵液變得粘稠，影響傳質(zhì)和傳熱[7]。此外，反應器中溶氧濃度亦對其發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素有影響。因此，對β-胡蘿卜素的發(fā)酵工藝條件仍需進一步研究。本文根據(jù)三孢布拉氏霉菌的異化作用類型、β-胡蘿卜素合成的代謝途徑、發(fā)酵液的流體性質(zhì)以及β-胡蘿卜素的理化性質(zhì)等特點，研究了氧載體、代謝前體物、表面活性劑、抗氧化劑等對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗菌株三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)，包括正菌ATCC 14271，負菌ATCC 14272，湖北工業(yè)大學輕工學部209實驗室保藏。

1.1.2實驗試劑馬鈴薯、大豆粉、玉米粉、大豆油，均為市售；玉米漿，山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司；2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)，阿拉丁生物試劑公司；丙酮酸鈉，BIOSHARP生物試劑公司；葡萄糖、甘油、液體石蠟、KH2PO4、MgSO4、VB1、Span-20，均為分析純并購于上海國藥集團。

1.1.3培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯(煮沸取浸出液)，100 g/L；葡萄糖，20 g/L；瓊脂粉，20 g/L；pH，自然。

種子培養(yǎng)基：大豆粉，30 g/L；玉米粉，30 g/L；KH2PO4，1 g/L；MgSO4，0.2 g/L；pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，85.9 g/L；玉米漿，30 mL；，大豆油10 mL；KH2PO4，5.3 g/L；MgSO4，0.5 g/L。VB1，0.01 g/L；pH, 7.0。

1.2儀器與設(shè)備

ZSD-1270型全自動新型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司； TG16-Ⅱ型高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司； ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；GW-2000型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面培養(yǎng)三孢布拉氏霉正負菌分別接種至斜面培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，待孢子長滿整個斜面。

1.3.2種子培養(yǎng)正負菌各取一環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL。培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，正負菌培養(yǎng)時間分別為20 h和25 h。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)將生長至對數(shù)期的正負菌株以1:9的比例按體積分數(shù)為6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL。培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，震蕩培養(yǎng)6 d。

1.3.4生物量(biomass)的測定搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用雙層紗布過濾，清水沖洗2次后，置于50℃真空干燥箱中烘干至恒重后稱量。

w=(M2-M1)×20

式中：w為生物量，g/L；M1為紗布的質(zhì)量，g；M2為烘干后紗布和干菌體的質(zhì)量，g；20即將生物量單位由g/50 mL換算成g/L。

1.3.5β-胡蘿卜素含量(β-carotene content)的測定將真空干燥后所得干菌體，用研缽研磨后準確稱取0.01 g的菌絲體粉末，將稱取的粉末加入50 mL石油醚避光萃取至無色。運用分光光度法在波長450 nm下測定其吸光度值，并依據(jù)標準曲線回歸方程計算出菌絲體中β-胡蘿卜素含量[8]

式中：φ為β-胡蘿卜素含量；C為由標準曲線的回歸方程算得的樣品濃度，μg/mL；m為萃取所用的干菌體質(zhì)量，g；V為萃取所用的石油醚體積，50 mL；1000即將β-胡蘿卜素含量單位由μg/g換算成mg/g。

1.4試驗設(shè)計

1.4.1液體石蠟對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過程中依次添加液體石蠟0、10、20、30、40 mL，發(fā)酵6 d后分別測定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.2丙酮酸鈉對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過程中依次添加丙酮酸鈉0.25、0.5、0.75、1 g/L，發(fā)酵6 d后分別測定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.3Span-20對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過程中依次添加0、0.025、0.05、0.075、0.1 mL，發(fā)酵6 d后分別測定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.4BHT對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過程中依次添加0、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L，發(fā)酵6 d后分別測定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.5甘油對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過程中依次添加甘油0、0.5、1、1.5、2 mL，發(fā)酵6 d后分別測定生物量及β-胡蘿卜素含量。

2結(jié)果與討論

2.1液體石蠟對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

三孢布拉氏霉菌的異化作用類型為需氧型，菌體生長過程中需要消耗大量氧氣。液體石蠟作為一種新的液相添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，一方面增加氧氣在其中的溶解度，另一方面減小氣液傳氧阻力，從而提高傳氧效率，同時可以引起三孢布拉氏霉菌體中的氧化應激反應，從而提高SOD酶和CAT酶酶活，有利于β-胡蘿卜素的合成[9-11]。

圖 1　液體石蠟添加量對生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖1可以看出，添加不同濃度的液體石蠟可以促進生物量的增加，液體石蠟的添加量為2%時，生物量達到最大。但是液體石蠟對三孢布拉氏霉合成β-胡蘿卜素并沒有促進作用，反而抑制了β-胡蘿卜素含量?？赡苡捎谄鋵ξ⑸锛毎幸欢ǖ亩拘裕瑢е铝甩?胡蘿卜素含量下降，但β-胡蘿卜素的產(chǎn)量仍有所提高。

2.2丙酮酸鈉對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定濃度的代謝前體物質(zhì)，可以控制生產(chǎn)菌的合成方向和增加目標產(chǎn)物產(chǎn)量。當代謝前體物是合成過程中的限制因素時，前體物質(zhì)加入量越多，目標產(chǎn)物產(chǎn)量越高。但前體物質(zhì)的濃度越大，利用率越低，甚至對產(chǎn)物產(chǎn)生抑制作用。丙酮酸是EMP途徑和TCA循環(huán)結(jié)點，一定濃度的丙酮酸能夠促進產(chǎn)能的增多。同時其能夠增加β-胡蘿卜素合成過程中IPP途徑通量，促進β-胡蘿卜素的合成[12]。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉，其與丙酮酸具有相似的作用。

圖 2　丙酮酸鈉添加量對生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖2可以看出，當丙酮酸鈉的濃度為0.5%時，生物量和β-胡蘿卜素含量都達到最大。其添加量大于0.5%時，生物量呈下降趨勢，β-胡蘿卜素含量也降低但維持在一定水平?？赡艹霈F(xiàn)中間產(chǎn)物抑制作用，使代謝供能途徑受阻，造成生物量下降。β-胡蘿卜素代謝支路也受到一定的影響，使β-胡蘿卜素含量降低至一定水平。

2.3Span-20對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

表面活性劑不僅能夠改變發(fā)酵液的流體性質(zhì)，有助于三孢布拉氏霉菌菌絲體的分散，而且能夠改變細胞膜的通透性，促進三孢布拉氏霉菌對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的分泌。Span-20具有特殊的疏水基團，并且比Span-60、Tween-80更易溶于水，具有獨特的理化性質(zhì)[13]。

圖 3　Span-20添加量對生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖3可以看出，當Span-20的添加量為0.1%時，生物量和β-胡蘿卜素含量都達到最大。繼續(xù)增加Span-20的濃度，生物量和β-胡蘿卜素含量減小，三孢布拉氏霉生長和代謝均受到抑制作用?？赡苡捎诟哂?.1%濃度的Span-20對細胞膜的通透性進一步增大，導致部分細胞破裂，或吸附于細胞周圍對細胞產(chǎn)生毒性，從而造成生物量的減少和β-胡蘿卜素的流失。

2.4BHT對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

β-胡蘿卜素具有較強的還原性，發(fā)酵過程中易被空氣中的氧氣氧化。BHT作為抗氧化劑被添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，可以在一定程度上保護生成的β-胡蘿卜素不被氧化，從而使β-胡蘿卜素含量提高[14]。

圖 4　BHT添加量對生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖4可以看出，添加不同濃度的BHT均對生物量和β-胡蘿卜素含量有促進作用?？赡苡捎贐HT對菌體生長所需的還原性酶類有保護作用，另一方面對合成的β-胡蘿卜素亦有保護作用。BHT的添加量為0.1%時，生物量和β-胡蘿卜素含量達到最大。當添加量大于0.1%時，生物量和β-胡蘿卜素含量均有不同程度的下降。可能由于高濃度BHT對細胞有一定的毒性，抑制了生物量和β-胡蘿卜素含量。

2.5甘油對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

甘油可以作為許多微生物利用的碳源，同時其還具有助表面活性劑作用。甘油被菌體代謝后產(chǎn)生丙酮酸，作為代謝中間物促進β-胡蘿卜素的合成。另外，其促進菌絲分散，細胞膜通透性增加，使傳質(zhì)和傳氧得到加強[15]。

圖 5　甘油添加量對生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖5可以看出，培養(yǎng)基中添加3%的甘油，β-胡蘿卜素含量達到最大。甘油濃度繼續(xù)增大，β-胡蘿卜素含量降低，但生物量仍舊呈上升趨勢?？赡苡捎谶^多的營養(yǎng)物質(zhì)被用于前期合成菌體，對后期產(chǎn)物的合成供能不足。過量的甘油可能進一步增大細胞膜通透性，造成菌絲體中β-胡蘿卜素含量減少。

3結(jié)論

1)通過研究多種代謝調(diào)節(jié)劑對三孢布拉氏霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，找到了不同代謝調(diào)節(jié)劑的最適添加量。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑BHT對提高三孢布拉氏霉菌菌絲體中β-胡蘿卜素含量的促進作用最大，說明發(fā)酵過程中β-胡蘿卜素的氧化是阻礙β-胡蘿卜素含量提高的主要限制性因素。2)研究了雙功能試劑甘油對三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，當其添加量為3%時，β-胡蘿卜素含量達到4.14 mg/g，較空白組提高了78.7%?？梢娖浔葐我恍拇x調(diào)節(jié)劑有更好的促進作用。

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[責任編校： 張眾]

Effect of Metabolic Regulator on β- Carotene Production by Blakeslea Trispora

YAN Xing, XIANG Mengxiong, WANG Changgao, DU Xin, LIN Jianguo, CAI Jun

(KeyLaboratoryofFermentationEngin.(MinistryofEducation),CollegeofBioengineering,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：Currently, problems such as low content of products, single metabolic regulation and so on exist in the fermentation production of β-carotene by Blakeslea trispora. In order to further improve the content of Blakeslea trispora’ s mycelium β-carotene, the present study added different metabolic regulators in the initial fermentation medium, exploring its impact on the β- carotene produced by Blakeslea trispora. The study found that fermentation medium added to 0.5% of pyruvic acid sodium, 0.1% of Span-20, 0.1% of butylated hydroxytoluene(BHT), 3% of glycerol can improve β- carotene content, which promote the greatest is antioxidant BHT, β- carotene content approach to 4.25mg/g, compared to the control group improved 72.1%. And different concentration of liquid paraffin could not increase β- carotene content, but the promotion of biomass production increases, so the production of β-carotene may be raised.

Keywords：Metabolic regulator; Blakeslea trispora; β- carotene

[中圖分類號]Q815

[文獻標識碼]：A

[文章編號]1003-4684(2016)01-0085-04

[作者簡介]閆興(1993-)， 男， 湖北洪湖人，湖北工業(yè)大學本科生，研究方向為生物工程 蔡俊(1968-)，男，湖北孝感人，湖北工業(yè)大學教授，研究方向為微生物發(fā)酵工程

[基金項目]國家自然科學基金(31401807)

[收稿日期]2015-07-24