尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖及bcl-2和Bax表達(dá)的影響

榮 杰 單長民

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尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖及bcl-2和Bax表達(dá)的影響

榮 杰 單長民

【摘要】目的 研究尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制。方法 通過MTT法檢測不同濃度尼美舒利（50μg/ml、100μg/ml、150 μg/ml）對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 72 h增殖的影響，并通過western-blot方法檢測Bax及bcl-2表達(dá)變化。結(jié)果 尼美舒利可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖，并且抑制率與作用濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，Bax的表達(dá)隨著尼美舒利濃度的升高而逐漸升高，bcl-2則逐漸降低，二者均與尼美舒利作用濃度呈良好的線性關(guān)系。結(jié)論 尼美舒利可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖，并可增強(qiáng)Bax的表達(dá)，抑制bcl-2表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】肝癌，尼美舒利，Bax，bcl-2

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（The hepatocellular carcinoma，HCC）為肝癌的一種，是死亡率最高的惡性腫瘤，也是我國常見的惡性腫瘤之一，其主要病理特征有侵襲性高﹑生長快速﹑轉(zhuǎn)移早以及預(yù)后差等［1］。目前針對(duì)肝癌的主要治療手段有手術(shù)﹑化療﹑肝移植﹑介入治療等［2］，從一定程度上延長患者的長期生存率，并改善患者的生活質(zhì)量，但是花費(fèi)巨大，同時(shí)均具有的共同特點(diǎn)是預(yù)后差，其整體的治療效果并未改善［3］，因此是臨床治療的難點(diǎn)，也是目前眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。但是關(guān)于肝細(xì)胞癌發(fā)生的確切分子機(jī)制還不清楚，目前仍然沒有有效的預(yù)防措施。本研究擬通過研究尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞生長增值的影響，并通過western-blot方法研究其對(duì)Bax和bcl-2表達(dá)的影響，旨在研究尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞生長增殖產(chǎn)生抑制的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：肝癌細(xì)胞株HepG2由濱州醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)研究所饋贈(zèng)。

主要試劑及儀器：尼美舒利購自美國sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和新生胎牛血清購自GiBco公司，MTT購自美國Bellancom公司，兔源Bax一抗，兔源bcl-2一抗和兔源β-actin一抗均購自中杉金橋公司，倒置相差顯微鏡 TS-100購自日本Nikon公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，蛋白電泳儀，轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞增殖影響 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，細(xì)胞濃度為10×104個(gè)/ml，每孔接種量為100 μl，分別加入RPMI 1640培養(yǎng)基配置成各濃度尼美舒利溶液至終濃度依次為50μg/ml﹑100μg/ml﹑150μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立含0.1%二甲基亞砜的RPMI1640培養(yǎng)基溶液為陰性對(duì)照組，也設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%，結(jié)果由（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示。

1.2.2 western-blot檢測尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Bax和bcl-2蛋白表達(dá)影響 取尼美舒利作用72 h后的HepG2細(xì)胞，裂解細(xì)胞后，12 000 rpm離心5 min，吸取上清液，加入5×上樣緩沖液，95℃煮10 min，12%分離膠SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂乳37℃封閉2 h，加入一抗Bax﹑bcl-2和β-actin（1：10 000），4℃孵育過夜，加入羊抗兔-HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL曝光液曝光，顯影，定影，用 LabWork4.5 分析軟件測定Bax﹑bcl-2和β-actin吸光度值，以β-actin為內(nèi)參，分別計(jì)算Bax﹑bcl-2和β-actin的比值為其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長抑制作用

不同濃度尼美舒利（50μg/ml﹑100μg/ml﹑150μg/ml）作用于肝癌細(xì)胞HepG2 72 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抑制率隨作用濃度升高呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，即隨著作用濃度的升高，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2抑制率逐漸上升，在150μg/ml濃度下對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長抑制率為42.37%，接近50%，且陰性對(duì)照組細(xì)胞抑制率基本為零，說明1‰濃度DMSO對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長無抑制，而尼美舒利可有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2生長和增值，且抑制效果與其濃度呈正相關(guān)。見圖1。

圖1　不同濃度尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長抑制率結(jié)果

2.2 Western-blot檢測尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Bax和bcl-2表達(dá)結(jié)果的影響

尼美舒利作用后Bax在肝癌細(xì)胞HepG2表達(dá)升高，bcl-2在肝癌細(xì)胞HepG2表達(dá)則逐漸降低，且與尼美舒利濃度呈良好的線性關(guān)系，并且經(jīng)一維方差差異性統(tǒng)計(jì)分析之后各濃度尼美舒利濃度組與陰性對(duì)照組肝癌細(xì)胞HepG2中Bax和bcl-2的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見圖2，圖3。

圖2　尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Bax及bcl-2表達(dá)結(jié)果的影響

圖3　尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Bax及bcl-2表達(dá)結(jié)果的影響

3 討論

尼美舒利（nimesulide）是由美國化學(xué)家GEORGE合成的磺酰苯胺類非甾體抗炎藥（non-steroidal antiinflammatorydrugs，NSAIDs）。該藥1974年獲美國專利，1980年轉(zhuǎn)讓瑞士赫爾辛公司（HelsinnHealthcare SA），1985年在意大利率先上市［4］。研究認(rèn)為NSAIDs抗腫瘤作用主要與環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）有關(guān)，環(huán)氧合酶有兩種異構(gòu)酶：COX-1和COX-2。其中，COX-2與腫瘤關(guān)系密切。Shiota等通過免疫組化染色研究發(fā)現(xiàn)，29例患者肝癌組織中有28例COX-2染色陽性，即陽性率為97%，在這28例陽性患者中含有7例高分化﹑3例中度分化和3例低分化患者，且癌組織與癌旁非癌組織相比COX-2染色要強(qiáng)，且在高分化肝癌患者組織中COX-2的表達(dá)率高于中度分化和低分化的肝癌組織（P＜0.05）［5］。且有研究發(fā)現(xiàn)COX-2與肝癌的分化程度﹑轉(zhuǎn)移及預(yù)后均密切相關(guān)，Kondo等通過研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在肝癌腫瘤術(shù)后表達(dá)高者生存率低［6］。因此，COX-2可能對(duì)肝癌的發(fā)生﹑發(fā)展﹑侵襲和轉(zhuǎn)移具有始動(dòng)或促進(jìn)作用，以COX-2為靶點(diǎn)的研究可能為臨床有效治療肝癌提供新的方向。有研究表明非甾體抗炎藥尼美舒利可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并能增加肝癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥的敏感性，但其具體作用機(jī)制并不清楚［7-8］。潘躍銀等研究發(fā)現(xiàn)尼美舒利與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其凋亡作用［9］。殷國志等研究發(fā)現(xiàn)，尼美舒利可誘導(dǎo)人肝癌SMMC7721細(xì)胞凋亡，這一作用可能與抑制HSP70表達(dá)有關(guān)［10］。本研究通過MTT法檢測不同濃度尼美舒利（50μg/ml﹑100μg/ml﹑150μg/ml）作用于肝癌細(xì)胞HepG2 72 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抑制率隨作用濃度升高呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，且在150μg/ml濃度下對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長抑制率為42.37%，接近50%；通過western-blot方法及RT-PCR方法研究Bax和bcl-2在尼美舒利作用后表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Bax在肝癌細(xì)胞HepG2表達(dá)升高，且隨著尼美舒利濃度的升高而逐漸升高，bcl-2則表達(dá)降低，二者均與尼美舒利作用濃度呈良好的線性關(guān)系。

綜上所述，尼美舒利對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有抑制作用，可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HepG2中Bax的表達(dá)，并抑制bcl-2的表達(dá)，這為尼美舒利抑制肝癌細(xì)胞增殖作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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Effect of Nimeisulide on Liver Cancer Cell HepG2 Proliferation and the Expression of blc-2 and Bax

RONG Jie SHAN Changmin Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

【Abstract】

Objective To investigate the effect of nimeisulide on liver cancer cell proliferation and the possible function mechanism.Methods To detect the cell viability of HepG2 through MTT assay after treated with nimeisulide 72 h at different concentrations（50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml），and to detect the expression of Bax and bcl-2 by western-blot method.Results Nimeisulide could inhibit the proliferation of HepG2 liver cancer cells，and inhibition rate presented dose-response relationship with nimeisulide concentrations，the expression of Bax increased with rising of concentration of nimesulide，but bcl-2 decedent，which both presented dose-response relationship with nimeisulide concentrations.Conclusion Nimeisulide could inhibit the proliferation of HepG2 liver cancer cells，and also could increase the expression of Bax，but decrease the expression of bcl-2.

【Key words】Liver cancer，Nimeisulide，Bax，bcl-2

通訊作者：單長民，E-mail：674650785@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.02.065

【中圖分類號(hào)】R735.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9316（2016）02-0087-03

作者單位：264003煙臺(tái)，濱州醫(yī)學(xué)院