一株醬醅中耐鹽酵母Meyerozyma guilliermondii的分離鑒定及其揮發性香氣成分分析

楊陽，鄧岳，劉彥希，劉絨梅，金玉蘭，楊志榮，孫群

(四川大學生命科學學院資源微生物與微生物技術四川省重點實驗室，四川成都610065)

一株醬醅中耐鹽酵母Meyerozyma guilliermondii的分離鑒定及其揮發性香氣成分分析

楊陽，鄧岳，劉彥希，劉絨梅，金玉蘭，楊志榮，孫群

(四川大學生命科學學院資源微生物與微生物技術四川省重點實驗室，四川成都610065)

為篩選具有醬油生產應用潛能的微生物菌株，以推動傳統產業與現代發酵的結合。從天然曬露法釀制醬油的第3年發酵醬醅中分離篩選到一株耐鹽酵母3－J15，經鑒定為季也蒙畢赤酵母Meyerozyma guilliermondii。選用固相微萃取－氣相色譜質譜聯用(SPME－GC/MS)技術，對分離株在鹽脅迫及非鹽脅迫條件下代謝產生的揮發性香氣成分進行分離測定。結果表明，從酵母3－J15發酵液中檢測出包含醛、酮、醇、酸、酯在內的10種特征香氣成分，其中主要的揮發性香氣物質為3－甲基－1－丁醇和2－苯基乙醇。綜合已有研究，這些呈香物質能夠為醬油的特色風味帶來正面影響，因此，酵母Meyerozyma guilliermondii具有進一步應用于醬油生產的開發潛力。

季也蒙畢赤酵母;醬油;香氣成分;SPME－GC/MS

0 引言

醬油俗稱豉油，是起源于中國的傳統調味品，它以多種氨基酸鹽復合物為主體，其香氣物質與多種微生物代謝產物(醇、酯、醛、酮、有機酸、呋喃等)密切相關［1］。具有悠久歷史的曬露釀制工藝采用天然制曲，菌種多而復雜，醬油成品滋味鮮美、口味醇厚［2］。雖然產品價格較高，但由于發酵啟動慢、發酵周期長、勞動強度大、市場份額低，這項傳統技藝的生存空間已越來越小，亟待拯救。已有研究表明，醬醅發酵過程中的微生物種類和數量繁多，微生物群落結構和相互作用機理較為復雜，它們對于醬油的品質及穩定性的形成有重要影響。

酵母菌目前已廣泛應用于啤酒、白酒、果汁等飲料的生產，其生物合成過程中會形成種類繁多的香氣物質，對產品風味影響較大［3］。關于產香酵母在醬油發酵中的應用研究，目前主要集中在耐鹽酵母Zygosaccharomyces rouxii和Candida versatilis上，前者主要產生乙醇、高級醇等風味物質［4］，后者能夠生成乙酸乙酯、乳酸乙酯及4－乙基愈創木酚［5］，這些產物對醬油特色風味的形成有著重要貢獻，已被研究者用于高鹽稀態發酵醬油的部分生產中［6］。

本研究從天然曬露發酵醬油的新鮮醬醅中篩選增香酵母，并通過固相微萃取－氣相色譜質譜聯用(SPME－GC/MS)的方法對其產香性能進行初步探究，旨在篩選具有食品開發潛力的酵母菌株，為研究酵母對醬油風味物質及質量安全的影響奠定基礎，同時為實現傳統發酵與現代工藝的產業化結合提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬醅樣品由四川省合江縣先市釀造食品有限公司提供，分別采自整個發酵過程中的第0.5，1，2，3，4年，每個年份的醬醅樣品均來自于5口不同醬缸(n =25)。醬缸位置的選取遵循隨機原則，稍作混合后從中心位置取料，保證每一醅料均從不同醬缸的同一位置、同一深度取到。樣品采集后，于4°C保存備用，并立即進行培養法實驗。

通用引物對ITS1/ITS4、NL1/NL4由Invitrogen公司(上海)合成;Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)，日本Takara公司;DNA Marker(D2000)、酵母DNA提取試劑盒、溶壁酶(Lyticase)，北京天根公司;瓊脂糖、氯化鈉、山梨醇、氯霉素、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出粉、瓊脂粉等生化試劑均購于成都博瑞克生物技術有限公司;小麥粉、黃豆粉、2－甲基－3－庚酮，購于成都云德科技有限公司。

PDA培養基(含氯霉素0.1g/L)、YPD、YPDA培養基按文獻［7］配置。發酵培養基:10 g黃豆粉，2.5 g小麥粉，50 g新鮮醬醅，用緩沖液Na2HPO4/ KH2PO4配置為1 L體系，煮勻攪拌后4層紗布過濾，pH 5～5.2;根據實驗設計分為額外添加150 g/L氯化鈉的鹽脅迫型及不添加氯化鈉的非鹽脅迫型。

1.2 主要儀器與設備

S1000 PCR儀、Wide Mini－Sub Cell GT型水平電泳槽、PowerPac Basic型電泳儀電源、Universal Hood II型凝膠成像系統，美國Bio－rad公司;Legend Micro 21R型高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司;AFZ－1002－U型超純水儀，美國Aquapro公司;75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭、手動進樣手柄，美國Supelco公司;DP73型顯微鏡成像系統，日本Olympus公司;UV－2450紫外可見分光光度計、QP2010 Plus型氣相色譜－質譜聯用儀，日本Shimadzu公司。

1.3 酵母的分離與鑒定

無菌操作條件下，取醬醅樣品5 g加至提前裝有玻璃珠的45 mL滅菌生理鹽水中，37℃搖床振搖15 min。取1 mL樣品懸液依次進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布于含100 g/L氯化鈉的PDA培養基上。于28℃培養72 h后挑選特征性菌落，經反復劃線純化后，接種至相應液體培養基進行擴大培養。提取目的菌株DNA，并使用通用引物ITS1/ITS4和NL1/NL4分別針對其ITS rDNA序列及26S rDNA D1/D2區域序列進行特異性擴增(引物序列如表1所示)，PCR反應條件為94℃預變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環30次;72℃延伸5 min。產物送Invitrogen公司進行測序。

另對目的菌株進行菌落形態觀察及顯微形態觀察。

表1 PCR引物序列

1.4 酵母生長特性的探究

對目的酵母生長的最適pH、最適溫度進行探究，并在最適pH、最適溫度、培養基氯化鈉含量為150 g/L的情況下，測定目的酵母的生長曲線。

1.5 酵母發酵液的制備

酵母于YPD液體培養基活化，4000 r/min離心，取無菌生理鹽水反復洗滌菌體，將1mL，5×106CFU/mL的菌體懸浮液加入到已調至酵母最適生長pH的30 mL發酵培養基中，在最適生長溫度下120 r/min搖瓶至生長穩定期，適當靜置，無菌條件下過濾收集發酵液。

1.6 SPME－GC/MS

準確吸取6 mL發酵液樣品和20 μL 2－甲基－3－庚酮稀釋液(5 μL/L)于15 mL頂空瓶中，加蓋密封，將已完成老化的萃取頭插入瓶子的頂空部分，于60℃的恒溫水浴中萃取30 min。檢測時以未添菌的發酵培養基為陰性對照。

樣品通過DB－5MS型彈性石英毛細色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行分離;程序升溫條件為起始溫度40℃，以3℃/min升到120℃，保持2 min，再以15℃/min升至250℃，保持2 min;載氣為高純氦氣(1.0 mL/min);分流比10∶1。

質譜采用電子轟擊電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;掃描范圍35～350 m/z。

對采集到的質譜圖利用NIST08和WILEY09譜庫檢索進行組分分析，并用氣相色譜峰面積歸一化計算出各香氣組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 耐鹽產香酵母的分離與鑒定

經過多次分離純化，從5種不同年份的發酵醬醅中共分離出酵母30余株，通過菌落形態比較及鏡檢觀察，共選出18株酵母進行分子鑒定，其中17株被鑒定為Meyerozyma guilliermondii，1株為Candida parapsilosis。

考慮到Meyerozyma guilliermondii在前人研究中的食品發酵背景以及Candida parapsilosis為條件致病菌，加之酵母對產品的增香作用主要集中于大分子物質已較大程度上被霉菌分解的發酵中后期，因此最終選擇了一株從第3年發酵醬醅中分離得到的酵母3－J15進行產香潛能探究。如圖1所示，根據菌落形態觀察，酵母3－J15菌落為乳白色，奶油狀，表面光滑，邊緣整齊;光學顯微鏡觀察發現細胞呈卵圓形，出芽生殖，無假菌絲。此酵母在不含鹽的PDA、YPDA培養基上可快速生長，在150 g/L鹽濃度的PDA、YPDA培養基上仍表現出良好的適應性。

圖1 酵母3－J15在YPDA培養基上的菌落形態及顯微形態觀察

以引物對ITS1/ITS4和NL1/NL4為擴增引物，分別對菌株DNA的目標序列進行特異性擴增，擴增產物經電泳后在1.5%瓊脂糖凝膠上呈單一條帶，無非特異擴增現象，條帶長短均約600 bp，如圖2所示。

圖2 酵母3－J15 PCR產物凝膠電泳圖譜

將測序得到的基因序列與NCBI數據庫中已有序列進行BLAST比對，NL1/NL4引物對擴增片段長604 bp，與GenBank中的Meyerozyma guilliermondii標準株NG_042640相似率達99%;ITS1/ITS4引物對擴增片段長611 bp，與Meyerozyma guilliermondii標準株NR_111247的相似率為99%，結合菌株培養及形態特征，可初步鑒定3－J15為一株Meyerozyma guilliermondii(也稱Pichia guilliermondii)，即季也蒙畢赤酵母。

2.2 酵母的生長特性

為了較為全面地了解M.guilliermondii 3－J15的生長特性，同時為接下來的搖瓶發酵提供實驗依據，對該菌株在YPD液體培養基中的兩項重要生長特性進行了測定。如圖3所示，該菌的最適生長溫度為30℃左右，最適生長pH范圍較廣，為4～8，鑒于醬醅在實際發酵過程中的pH為5左右，在接下來的生長曲線測定及發酵培養基配置步驟中均采用pH 5。

圖3 酵母3－J15的生長pH及溫度曲線

在滿足最適溫度、最適pH且培養基中氯化鈉含量為150 g/L的條件下，對菌株3－J15的生長情況進行了測定，得到其在26 h內的生長曲線。如圖4所示，經1～2 h的適應期后，菌株逐漸進入對數期，生長旺盛，18 h后進入穩定期，菌株生長速率逐漸平穩，代謝產物積累。

圖4 酵母3－J15的生長曲線

2.3 酵母發酵液香氣成分的GC－MS分析

經譜庫檢索及資料分析，酵母3－J15在非鹽脅迫環境(培養基含鹽量約0.9%，鹽分僅來自于作為營養成分添加的醬醅中本有的氯化鈉)及鹽脅迫環境(培養基含鹽量約15%，鹽分來自于醬醅及額外添加的氯化鈉)下發酵產生的代謝產物中，主要的揮發性香氣成分如表2所示。

鹽脅迫存在與否對于揮發性香氣物質產生的差異在于當培養基中添有150 g/L的氯化鈉時，酵母額外代謝產生2－甲基丁醛、2－甲基丙酸、丁酸丙烯酯，當不存在鹽脅迫時，酵母可代謝產生2－丙酸乙烯酯、3－甲基－2－戊酮。已有研究表明，當鹽脅迫存在時，埃切假絲酵母分解底物產生乳酸、檸檬酸、琥珀酸的能力增強［8］，釀酒酵母糖酵解途徑各支路的代謝產物通量均有所增加，而三羧酸循環(TCA)中各代謝產物的通量均有所減少［9］。這反映出鹽脅迫能夠對酵母生長代謝中的某些通路造成影響，代謝通量由此發生改變。可以推測，揮發性代謝產物的累積同樣會受到來自代謝層面的影響，產生本研究結果中所反映出的這些差異。

表2 酵母3－J15在鹽脅迫及非鹽脅迫條件的主要揮發性成分相對含量%

而無論鹽脅迫是否存在，酵母菌株M.guilliermondii 3－J15均能夠通過代謝產生2－苯基乙醇、3－甲基－1－丁醇、2－甲基丁酸、3－甲基丁酸、丁酸乙酯等香氣成分;其中，2－苯基乙醇和3－甲基－1－丁醇的相對含量遠超其余成分，成為發酵液中主要的揮發性香氣物質。Feng等［10］通過研究發現3－甲基－1－丁醇是高鹽稀態發酵醬油中最強烈的香氣活性化合物之一，并證明在產品中添加適量3－甲基－1－丁醇能夠對其最終口感貢獻具有正面影響的酸味和焦糖味(p＜0.05)。2－苯基乙醇作為酵母菌降解苯丙氨酸的代謝產物［11］，具有花草香味和瓜果氣息，已被研究者用作醬油和豆瓣醬等發酵產品的增香手段［12］。2－甲基丁酸、3－甲基丁酸常見于多種醬油的特征性風味成分中［13－14〗］，酸可以緩解醬油中的咸味，使各種香味柔和［15］。丁酸乙酯出現在菠蘿［16］、西番蓮［17］等果實的香氣中，具有典型的甜果香，目前已廣泛應用于日化、食用香精生產。

以上結果表明，酵母3－J15在15%鹽濃度下生長良好，并能夠適應較廣的pH范圍，同時可發酵產生多種提升醬油風味的香氣物質。Aryuman等［18］曾從泰式醬油的發酵醅料中分離得到一株M.guilliermondii，它能夠產生谷氨酰胺酶且酶活性在18%高鹽濃度下達到最大，直接加速了從L－谷氨酰胺生成L－谷氨酸的反應，對產品鮮味的呈現具有重要貢獻。鑒于這些特性，本研究篩選得到的酵母3－J15在醬油發酵的人工高鹽環境中具有較強的應用潛力，值得進一步開發利用。

3 結束語

本研究從天然曬露法釀制醬油的第3年發酵醬醅中分離篩選到一株耐鹽酵母3－J15，經鑒定為季也蒙畢赤酵母。綜合前人研究，這株從醬醅中篩選得到的土著菌株代謝產生的多種呈香物質能夠為醬油的特色風味帶來正面影響，在醬油發酵的高鹽環境中具有較強的應用潛力，值得進一步開發利用，可首先作為培養起始物試用于醬油生產的制曲及發酵過程中。

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(編輯:莫婕)

Molecular identification and analysis of volatile aroma components of a halotolerant yeast，Meyerozyma guilliermondii isolated from soy mash

YANG Yang，DENG Yue，LIU Yanxi，LIU Rongmei，JIN Yulan，YANG Zhirong，SUN Qun
(Sichuan Key Laboratory of Resource Microbiological and Biotechnology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

In order to screening microorganisms which have the potential for further application in soy sauce production from the natural sun－brewed fermentation to promote the combination of traditional and modern industry.In this study，a halotolerant aroma－producing strain 3－J15 was isolated from the soy mash of the 3rdyear fermented by natural sun－brewed manufacturing，which was identified as Meyerozyma guilliermondii.The metabolites of 3－J15 in a given growing environment with or without salt stress were further analyzed by solid－phase micro－extraction coupled with gas chromatography/mass spectrometry (SPME－GC/MS).A general volatile profile of 10 characteristic aromatic substances including aldehyde，ketone，alcohol，organic acid and ester was obtained.Among them，the major volatile compounds were 3－methyl－1－butanol and 2－phenylethanol.Combined with the previous studies，these aromatic substances were deemed contributive to have a positive impact on the characteristic flavor of soy sauce.Therefore，this strain of Meyerozyma guilliermondii has the potential for further application in soy sauce production.

Meyerozyma guilliermondii;soy sauce;aroma components;SPME－GC/MS

A

1674－5124(2016)11－0055－05

10.11857/j.issn.1674－5124.2016.11.012

2016－06－09;

2016－08－01

川大－瀘州科技合作項目(2014CDLZ－S09)

楊陽(1992－)，女，四川自貢市人，碩士研究生，專業方向為工業微生物。

孫群(1967－)，女，教授，博士，研究方向為微生物技術與食品安全。