細菌共培養及其系統中群體感應現象的研究進展

勵建榮,國競文,李婷婷

(1.渤海大學食品科學研究院,遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.西南大學食品學院,重慶 400715)

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細菌共培養及其系統中群體感應現象的研究進展

勵建榮1,國競文1,李婷婷2,3,*

(1.渤海大學食品科學研究院,遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.西南大學食品學院,重慶 400715)

本文對微生物的共培養方式、分類、發展及應用進行了簡介,并對不同種屬的微生物共培養后產生的作用進行了綜述。微生物共培養系統不僅受到協同代謝作用的調控,群體感應在微生物共培養中也扮演著重要的角色。與純培養相比,共培養體系生物被膜的形成、信號分子和毒力因子的產生、細菌素的合成以及胞外蛋白酶的分泌等都有所不同。研究群體感應的作用機理有助于共培養技術的進一步發展與應用。

微生物,共培養,協同代謝,群體感應

人們對微生物的研究大多局限于純培養方式,對于微生物共培養的研究較少,其實微生物共培養存在著巨大的研究潛力,不同種屬的微生物之間共培養后會產生迥然不同的作用[1]。目前對于共培養的研究大多都是從協同代謝出發的,很少有人涉足群體感應對共培養體系調控作用的研究,直到最近才有人開始關注群體感應在共培養中的作用。共培養(Co-culture)是指在無菌條件下,一些特別指定的不同的微生物在厭氧或好養條件下的混合培養[2]。群體感應(Quorum-sensing,QS)系統是細菌間利用信號分子進行交流的一種方式,即當細菌的菌體數量達到一定密度時細菌會發生感應現象進而調控性狀表達[3]。一般來講,群體感應對單個細菌菌體是沒有意義的,而對大量的細菌菌體來說是非常重要的,真核生物或是原核生物都具有群體感應現象。食品處于復雜的微生物體系中,多種微生物在同一環境中會產生不同的作用,因此僅僅研究群體感應對微生物純培養的影響遠遠不夠,對于共培養體系中群體感應調控作用的研究迫在眉睫。因此本論文主要針對微生物共培養系統中的群體感應現象做出論述,旨在為微生物共培養技術的發展及共培養系統中群體感應調控作用的研究提供一定的理論基礎。

1 微生物共培養

1.1 共培養的簡介

人們對于微生物的利用是一個逐步發展的階段,最初只是天然的混合培養(Mixed-culture),比如傳統發酵食品如乳制品、豆制品、肉制品的制作以及食醋、黃酒等的釀造均是利用了發酵體系中多種微生物之間的代謝作用。在18世紀末期純培養(Pure culture)技術開始發展,同時極大的促進了醫學、生命科學和工農業等領域的發展。在1925年Sack[4]首次報道了關于微生物共培養的研究,指出亞消化單胞菌(Nitrosomonassp.)和生絲微菌(Hyphomicroblumsp.)在硅膠培養基中共培養時組合關系不同則形成不同的產物。最近幾十年人們又逐漸認識到多種不同種屬的微生物共培養能夠產生特有的新物質或者提高產量[5-7]。共培養微生物之間有著較為復雜的生態學關系,其中涉及協同代謝、互利共生、相互拮抗、細菌素、信號分子之間的相互作用等,這些作用在一定程度上都影響著共培養體系中物質的產量和新物質的產生。

1.2 共培養的方式及特點

微生物的共培養方式主要分為直接共培養、共固定化細胞混菌培養和間接共培養三種。直接共培養是指在一定的環境條件下,兩種或兩種以上細胞按照特定比例在同一體系中共同培養的過程。在這種培養方式中常伴隨著協同代謝、信號轉導、群體感應等多種復雜的微生態關系,共固定化細胞混菌培養是指采用共固定化生物技術將單個細菌制成固定化細胞后混合在一起。利用這種培養方式在避免了微生物直接接觸產生抑制作用的同時又可以發揮代謝物之間的信息傳遞。間接共培養是指將不同的微生物細胞置于特定的、互不接觸的載體上而在同一體系中培養[2]。這種共培養方式的優點與共固定化細胞混菌培養相同,雖然實際應用中這種方式沒有被廣泛采用,但是理論上它對于研究微生物代謝產物之間的相互作用以及揭示種間的群體感應現象和信號分子的產生有重要意義。

1.3 共培養的應用

利用共培養技術可以改造傳統的發酵工藝,使發酵周期縮短且產品質量提高,如利用戊糖乳桿菌和腸膜明串珠菌共培養生產泡菜,在降低泡菜中腐敗菌數目的同時還可以改善泡菜的風味[8]。共培養可以產生新的物質,如將枯草芽孢桿菌與放線菌共培養能夠產生純培養時不存在的抗腫瘤抗生素[9],顯示了共培養對于新抗腫瘤抗生素發現的重要性。共培養可以提高物質產量,如將巨大曲霉和尖孢鐮刀菌共培養時發現抗真菌蛋白的產量明顯提高[10],這是微生物共培養技術的一大優勢,在當下的研究中也備受關注。共培養可以降解有毒物質,這可能是源于微生物共培養時產生的協同作用,因此在降解有毒物時更加高效,如同時使用透明分枝桿菌與枝孢菌清除柴油時可以顯著提高清除率[11]。

2 協同代謝作用對共培養的調控

共培養微生物之間存在多種協同代謝作用,如為彼此提供營養物質、對底物的競爭利用、改變體系的pH等。有報道指出細菌在純培養時生物活性容易降低,生物量也會減少,但是將細菌進行混合培養在一定程度上可以減少或避免這一現象的發生[12-13]。這可能是由于細菌混合培養后產生了協同作用,細菌間的代謝增加。巨大芽孢桿菌與古龍酸菌共培養時能夠為彼此提供營養物質,因而新陳代謝增強[14]。

Huang等[15]對分離自肉制品中的兩株糞腸球菌Enterococcusfaecium(E.faeciumB1和E.faeciumB2)與單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)進行了共培養研究,E.faeciumB1中含有類細菌素物質和腸道菌素基因,而E.faeciumB2中沒有,并且二者對L.monocytogenes都有一定的抑制作用。在共培養的早期E.FaeciumB1對L.monocytogenes有抑制作用,而E.faeciumB2沒有產生抑制作用,由此推測是E.FaeciumB1中的類細菌素物質對L.monocytogenes的生長產生了抑制作用。同時測定了培養液中的pH發現,共培養的pH低于單一純培養的pH,表明共培養時產生的酸性物質抑制了L.monocytogenes的生長。對于沒有產細菌素基因的E.FaeciumB2來說,它對L.monocytogenes的抑制作用可能是由于細胞與細胞之間對于營養物質的競爭作用。例如Nilsson等[16]已經證實,不產細菌素基因的棲魚肉桿菌會因為競爭葡萄糖而對李斯特菌產生抑制作用。

Mellefont等[17]對單増李斯特菌(L.monocytogenesScott A)與大腸埃希式菌(E.coliM23)、熒光假單胞菌(P.fluorescens44)、乳酸桿菌(L.plantarumALC 01)分別進行共培養的研究中發現,混合體系中的協同增長的作用差異與混合培養濃度比例有一定關系,當混合濃度相當時,協同增長作用最顯著;當共培養L.monocytogenesScott A初始濃度較低時,它的生長會受到其它細菌的抑制;相反,當L.monocytogenesScott A初始濃度比P.fluorescens44和L.plantarumALC 01高時,P.fluorescens44和L.plantarumALC 01的生長都會受到抑制,但是E.coliM23的生長不受影響,共培養體系的pH也會發生相應變化。推測原因可能是共培養時某一個細菌分泌了對其它細菌生長不利的抑制因子,也可能是由于對培養體系中底物的利用能力不同產生的生長差異。此外肉湯培養的溫度不同也會影響共培養中單增李斯特菌與植物乳桿菌的競爭作用[18]。除此之外,Geng等[19]也曾報道過將硝化細菌和反硝化細菌進行混合培養能夠加速硝化反應的進程還能穩定系統中的pH。

對于微生物共培養的研究大多都是從協同代謝角度出發的,從群體感應角度研究的較少,然而群體感應在微生物共培養中扮演著重要角色。

3 群體感應系統

3.1 細菌群體感應

細菌的群體感應依賴細菌的數量達到一定密度才能發生,細菌可以通過產生、釋放、檢測以及對信號分子做出相應的反應來實現菌體之間的交流,這些信號分子又稱“自誘導物(Autoinducer,AI)”。人們最早是在20世紀70年代從海洋費式弧菌(Vibriofisheri)中發現了群體感應現象的存在[20],費式弧菌能夠調控發光,而群體感應可以調控發光的強度[21],并且這種發光現象與菌體數量有關,當費式弧菌菌體濃度增加時,AHLs信號分子的濃度也會相應升高,當達到一定閾值后就會與受體蛋白結合,使受體蛋白的構象發生相應變化,靶基因被激活[22]。鑒于群體感應現象的發現,科學家的注意力從研究單個細胞的行為轉移到多細胞行為的研究上,并且人們發現QS與果蔬的腐爛、水產品的腐敗、牛奶及奶制品的腐敗等密切相關,QS現已經廣泛應用到醫藥、生物防治、食品質量安全和水產品腐敗控制等方面。介導微生物群體感應的信號分子有多種,而不同種類的細菌在調控QS系統的基因表達時利用的信號分子結構不同。

3.2 群體感應系統的分類

常見的QS系統主要分為以下4類:

革蘭氏陰性菌中的群體感應系統(AI-1):革蘭氏陰性細菌的群體感應系統,主要分泌的是N-酰基-高絲氨酸內酯(N-3-acyl-homoserine lactones,AHLs)類物質,也叫做AI-1,它是由一個相對穩定的高絲氨酸內酯環和一條長度包含4至18個碳的酰基側鏈組成,其酰基側鏈上可能形成雙鍵或第三個碳上容易被羥基或氧取代,這些可變性決定了AHLs的特異性[23]。目前已在許多細菌中發現類似費式弧菌LuxI/LuxR系統的群體感應系統,如根癌農桿菌的TraI/TraR系統,銅綠假單胞菌的LasI/LasR系統和Rh1I/Rh1R系統等[24]。

革蘭氏陽性菌的群體感應系統(AIP):革蘭氏陽性菌的信號分子為寡肽(auto-inducing polypeptides,AIPs)類物質,它與AI-1結構不同,是經過加工或修飾的自身分泌的前導肽。AIPs有直鏈的也有環狀的,含有5～26個氨基酸殘基[25-26]。AIPs不能自由出入細胞,要經過細胞壁需在ABC轉運系統的協同作用下才能達成[27]。

細菌種屬間的群體感應系統(AI-2):除了以上兩類信號分子之外,細菌用于種間交流的是另外一類信號分子AI-2(autoinducer-2),細菌通過感受環境中AI-2的濃度從而了解環境中自身和其他細菌的數量,以此來調控自身的表型表達。AI-2類信號分子是由LuxS蛋白質催化合成的呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)[28]。

細菌的其他群體感應機制:在一些腸道共生細菌、腸致病性大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中發現了AI-3型群體感應系統,但是其作用機制尚不明確,推測結構可能和腎上腺素/去甲腎上腺素相似,且E.coli中AI-3分子的合成并不依賴于LuxS蛋白[29];在銅綠假單胞菌中還發現了2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(2-heptyl-3-hydroxyl-4-quinolone)類信號分子,其次級代謝產物可以調控假單胞菌毒性基因的表達;在弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)等細菌的培養上清液中發現了二酮哌嗪類化合物DKP(diketopiperazine),也是AI信號分子的一種,這類信號分子對細菌種內及種間的群體感應都起著重要的調控作用[30]。

4 群體感應對共培養的調控作用

群體感應調控著細菌共培養的多個方面,比如生物被膜的形成、信號分子的產生、毒力因子的產生、細菌素的合成、胞外蛋白酶的分泌等。

4.1 對生物被膜的調控作用

生物被膜是指微生物為了適應環境而粘附于惰性或活性實體的表面,繁殖、分化并分泌一些多糖基質、蛋白質和核酸等,將菌體群落包裹其中而形成的細菌聚集體膜狀物[31]。被膜的形成是一個多級過程,包括細菌表面的粘附,細胞間集聚和繁殖,多聚基質的產生、生長、成熟,最終被膜分散或降解。QS的調控涉及被膜形成的所有階段,它通過調節細菌的種群密度和成熟被膜內的新陳代謝來適應營養需求[32]。生物被膜普遍存在于食品表面和食品的加工車間中,清除困難且容易導致食品的二次污染。在生物被膜的保護下,細菌應對抗生素、環境壓力以及來自外界的攻擊防御能力都會增強。因此抑制生物被膜的形成在一定程度上可以延長食物保質期。有關生物被膜的最早報道是Costerton等[33]對于牙斑菌的生物被膜的研究,近年來有大量研究表明,許多菌種生物被膜的形成都受到群體感應系統的調控。Brackman等[34]研究了伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)生物被膜的形成,發現其受群體感應系統的調控,并且肉桂醛和白藜蘆醇有抑制生物被膜粘附的能力。群體感應對生物被膜的調控作用不僅僅局限于單個細菌的純培養中,對于不同種屬細菌的共培養體系也會有一定的影響。楊安林[35]曾提到,加入細菌培養上清液后大腸桿菌生物被膜OD630的值比單獨培養大腸桿菌有所增加,尤其是金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的上清液能夠明顯增強大腸桿菌生物被膜的形成能力,并且加入量、OD值與生物被膜形成能力之間呈現一定的濃度依賴性;加入銅綠假單胞菌和單増李斯特菌后OD630值增幅不明顯。這表明不同種屬細菌進行共培養時體系的生物被膜形成能力存在差異性,充分了解復雜的共培養體系中生物被膜的形成規律,找到有效抑制生物被膜形成的方法,有利于控制由于生物被膜粘附而導致的食品污染與腐敗現象。

4.2 對信號分子的調控作用

朱晶等[36]對多株乳酸菌、腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)和豬小腸上皮細胞系IPEC-J2共培養發現,乳酸菌能夠使ETEC對IPEC-J2的毒力作用顯著降低,其中乳酸菌S8能夠明顯促進ETEC的AI-2分泌。這表明乳酸菌可能通過向環境中分泌某種物質來影響ETEC LuxS系統AI-2的產生,使ETEC的毒力基因無法正常表達。郭倩茹等[37]對分離自酸馬奶酒中的9株乳酸菌、8株酵母菌進行兩次共生篩選后得出了三對典型的共生組合,酵母菌YSTT2代謝產物均能促進LAB4、LAB7、LAB9這3株乳酸菌產生AI-2,共培養YST2與LAB4、YST2與LAB9極顯著的促進了乳酸菌AI-2的產生。Di等[38]將酵母乳桿菌LactobacillusplantarumDC400與其他乳酸桿菌共培養時發現DC400的LuxS基因調控的AI-2的產生會受影響。以上研究表明,微生物共培養會影響信號分子AI-2的產生。由于共培養體系可能同時受到多種信號分子的調控,因此僅僅研究共培養液中AI-2的變化還遠遠不夠,對于添加外源AI-2后是否也會產生類似的趨勢還有待于進一步驗證。

4.3 對毒力因子產生的調控作用

毒力因子可以幫助病原體侵入宿主,并且對于宿主的自我防御功能有相應的抵抗機制,從而使病原體更具致病危害性。研究表明,一些QS系統參與了毒力因子的產生和運輸過程。如葡萄球菌毒力因子的產生會受到QS的調控[39]。在創傷弧菌中,溶血素基因vvhA和蛋白酶基因vvpE在其QS系統中起重要作用[40]。何夙旭等[41]曾報道,嗜水氣單胞菌NJ-1與芽孢桿菌R1共培養時,僅能檢測出少量的AHLs信號分子,毒力因子相關基因表達量均顯著下調;LuxR表達受到抑制,LuxS在36h表達量明顯增多,不影響QseB的正常表達,并且指出R1抑制NJ-1毒力因子相關基因表達的原因可能是R1對NJ-1的多種QS系統都有調控作用。已有研究表明,某些物質對毒力因子的產生有一定的抑制作用,如大蒜提取物[42]和梔子苷[43]可以通過QS系統抑制銅綠假單胞菌的毒力因子表達,降低其致病性。是否存在某種物質能夠同時調控共培養體系中多種細菌的毒力因子的產生,還有待于進一步的研究。

4.4 對細菌素產生的調控作用

細菌素是細菌為了適應不利的生長條件或者環境變化而產生的一類具有生物活性的蛋白質、多肽,當這些物質積累到一定的數量后對同一生長體系中的其他微生物會產生抑制作用[44]。細菌素合成對條件依賴性很大,如溫度、pH、應激、離子強度等都會影響細菌素產生量。當前研究已證明在乳酸乳球菌、糞腸球菌、植物乳桿菌等中存在著調控細菌素合成的QS機制[45]。更有研究表明在進行共培養時,其他種屬的細菌會利用QS來調控細菌素的產生菌來合成細菌素。如與特定的革蘭氏陽性菌共培養可誘導植物乳桿菌細菌素的合成[46-47]。LactobacillusplantarumJ23與LactobacillusplantarumNC8具有相同的群體感應雙組分調節系統[48],當LactobacillusplantarumNC8與特定的革蘭氏陽性菌共培養時,可促進細菌素的合成和提高自體誘導物的活性,這對于維持細菌素的合成有很大幫助[49-50]。在液體培養基中對LactobacillusplantarumNC8進行純培養時是無法合成細菌素的,但當與LactococcuslactisMG1363共培養時,細菌素合成量大大增加[51-52]。在共培養體系中,芽孢桿菌會在與其親緣關系較近的其他微生物的作用下產生大量細菌素,這種作用與種間群體感應密不可分[53]。由于細菌素可以作為發酵劑的發酵副產物存在于奶制品中,而植物乳桿菌作為誘導菌對乳酸菌產細菌素具有一定的調控作用,并且此調控作用與QS有很大關聯。因此研究群體感應對于共培養體系中細菌素的合成具有很大的實際應用價值。

4.5 對分泌蛋白酶的調控作用

具有蛋白水解酶的細菌可以水解食品腐敗過程中產生的蛋白質,產生一些小分子物質為自身提供營養同時也會被處于同一環境中的其他微生物所利用[54],產蛋白酶豐富的細菌則會成為食品腐敗過程中的優勢腐敗菌。因此研究多種細菌的生長體系中蛋白酶的變化有助于掌握食品的腐敗機制。相關研究表明,群體感應AHLs能夠調控銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)蛋白水解酶的基因表達[55-56]。劉敏等[57]將芽孢桿菌與嗜熱鏈球菌共培養發現,芽孢桿菌會促進嗜熱鏈球菌的生長,且芽孢桿菌分泌的蛋白酶會水解乳中蛋白質產生寡肽和氨基酸等物質,正是這些物質促進了嗜熱鏈球菌的生長。黃艷等[58]將輔助菌與橙色粘球菌共培養時發現輔助菌有助于粘細菌產生次級代謝產物,而產生這種狀況的原因可能是由于共培養的微生物在生長過程中各自產生的酶類之間有相互協同的作用。本實驗室利用從腐敗大菱鲆中分離到的兩株熒光假單胞菌(PF-04)和嗜水氣單胞菌(AH-01)進行共培養時發現,共培養液產胞外蛋白酶的能力均好于這兩株菌的純培養液,說明共培養后兩株菌產生了協同作用,當改變兩株菌共培養的初始濃度時會產生不同的共生效果。由于PF-04為大菱鲆的優勢腐敗菌,而AH-01為非優勢腐敗菌,故本實驗將這兩株菌進行共培養,目的在于研究共培養體系中非優勢腐敗菌對優勢腐敗菌分泌蛋白酶能力的調控作用,進而為延緩食品腐敗提供理論依據。

綜上所述,群體感應在微生物共培養體系的多個方面都有調控作用,如生物被膜的形成、信號分子的產生、毒力因子的產生、細菌素的合成、蛋白酶的分泌等,且不同種屬的細菌之間共培養體系的變化不同。

5 共培養存在的問題與展望

信號分子決定了共培養微生物之間的不同生態行為,充分利用共培養技術可以幫助人類發現更多新的種間信號分子。對于共培養中群體感應現象的研究可以結合代謝組學、基因組學和蛋白質組學技術。雖然科學家已經對部分菌株共培養體系中的QS機制有了初步的認識與研究,但是到目前為止還有許多問題亟待解決。比如共培養體系中目標菌通過什么方式感知環境中其他菌株產生的信號分子？如何激發自身及其他菌株的誘導機制？具體是哪一類信號分子產生的作用等。

現在大多數研究只限于兩種不同種屬的細菌之間,對于三種或三種以上種屬的細菌同時進行共培養的研究還未曾見報道,未來要致力于群體感應在三種以上細菌的培養體系的研究;對于共培養體系中群體感應調控的其他因子如群集泳動、嗜鐵素的產生以及質粒的結合轉移等也有待于探索;且目前對于共培養體系的設立大多是利于細菌生長的環境條件,對于極限條件下(環境脅迫)對共培養體系中群體感應的變化值得研究;在共培養的不同階段檢測體系中產生的信號分子種類及各類型信號分子的含量變化,有助于了解共培養時期信號分子等相關指標的動態變化規律。

綜上所述,我們要對微生物的共培養進行多角度、多層次、全方位的研究,為進一步了解共培養機理及群體感應在共培養中的作用提供理論基礎。

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Research progress of quorum sensing phenomenon in microorganisms co-culture system

LI Jian-rong1,GUO Jing-wen1,LI Ting-ting2,3,*

(1.Liaoning Provincal Key Laboratory of Food Safety,Food Science Research Institute,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.College of Life Science,Dalian Nationality of University,Dalian 116600,China; 3.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The method,classification,development,application of microbial co-culture were introduced,and the effects of co-culture of different species were summarized.Microbial co-culture system was regulated not only by the collaborative metabolism,but also by quorum sensing in microbial cultures. Compared with the pure culture,biofilm formation,signaling molecules,virulence factors of production,bacteriocin synthesis and secretion of extracellular protease of co-culture system were different. The research of action mechanism of quorum sensing would improve further development and application of cultivation technology.

microorganisms;co-culture;quorum sensing;synergy metabolism

2016-06-24

勵建榮(1964-)，男，博士，教授，主要從事水產品和果蔬貯藏加工，食品安全方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

*通訊作者:李婷婷(1978-)，女，博士，副教授，主要從事水產品貯藏加工及質量安全方面的研究，E-mail：tingting780612@163.com。

國家自然科學基金(31301572，31301418)；中國博士后科學基金(2014M552302)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)23-0377-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.062