自噬相關機制在顱腦創傷中的研究進展

劉 源 王 蓉

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 北京腦重大疾病研究院，北京 100053)

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· 神經系統疾病的基礎研究 ·

自噬相關機制在顱腦創傷中的研究進展

劉 源 王 蓉*

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 北京腦重大疾病研究院，北京 100053)

顱腦創傷(traumatic brain injury,TBI)是世界范圍內年輕人和成年人致殘的最重要的原因之一。病死率高，而幸存者常伴有身體的殘疾、精神障礙等后遺癥，為社會發展帶來了沉重的負擔。自噬是近年來研究的一個熱點領域，近年來關于TBI繼發性損害機制中自噬的研究逐漸增多，但仍有許多機制有待闡明，本文將從TBI后自噬的變化以及其相關機制進行闡述。

顱腦創傷；自噬；自噬相關機制

顱腦創傷(traumatic brain injury，TBI)是指因開放或閉合性腦損傷引起的腦功能損害。世界范圍內每年因高空墜落、車禍、運動或戰爭及其他原因導致TBI而就醫的就有數百萬人[1]。TBI病死率非常高，而幸存者常伴有記憶力和注意力的下降，以及信息處理障礙等問題。TBI中一些細胞死亡由原發性損傷引起，如直接機械性損傷；但是更多的細胞死亡是由之后的繼發性損傷引起的，這些繼發性損傷機制主要包括：氧化應激、炎性反應、神經遞質功能障礙、線粒體功能障礙、凋亡、自噬等[2-6]。自噬是近年來研究的一個熱點領域，是細胞降解損傷及喪失功能的細胞器或蛋白, 維持細胞更新和穩態的關鍵細胞機制。自噬可通過不同的途徑, 將細胞中的物質運送到溶酶體進行降解,包括：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬。通常所說的自噬即指大自噬。近年來關于TBI繼發性損傷機制中自噬的研究[7-10]雖有增多，但仍有許多機制尚未明確，本文將從TBI后自噬的變化以及其相關機制進行闡述。

1 TBI后自噬相關蛋白及自噬流的變化

關于腦外傷治療的研究主要集中于通過調節細胞死亡程序中的相應靶點來保護神經元。除直接機械性損傷引起的細胞死亡外，凋亡與自噬性細胞死亡也占有相當比例，而自噬對于受損細胞既存在保護作用也可加劇細胞損傷，主要取決于自噬在損傷后所處的作用傾向及階段。自噬參與了創傷性腦損傷后細胞生存和死亡機制的調節。因此，研究TBI后自噬在神經損傷和修復中所起的作用意義重大[11]。已有文獻[12-13]報道了的TBI后自噬相關生物化學過程的改變。然而，直到現在其具體的機制及其所起的作用也未被完全闡明。一些文獻[13-15]從不同角度證實創傷性腦損傷后會出現不同程度的自噬增加現象，但具體機制和功能仍存在爭議。

目前已經開始明確的是因外傷引起的自噬水平及自噬流的改變，以及干預的措施及潛在的治療靶點。TBI后4 h用電鏡觀察到大鼠損傷部位的大腦新皮質(皮質3～5層)周圍自噬體及自噬溶酶體是增加的，并在傷后的5～15 d用熒光共聚焦顯微鏡觀察到了LC3-Ⅱ陽性細胞數量的增加以及自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG) 12-ATG5結合物增加[12]。同樣，有研究[13]顯示人類TBI后3.5 h開始LC3也出現了升高。許多研究[14-16]指出，在TBI后數周至數月自噬標志物仍保持較高水平。這種長期的自噬增加不僅存在于自噬急性期，而且存在于慢性期中，并伴隨神經退行性變和/或神經恢復的過程。需進一步在TBI造模后通過長期的觀察來闡明這種持續的改變。

現在尚未明確的是TBI后自噬體的增加是因為自噬體生成增加，還是因為自噬流增加或自噬體降解障礙而引起的自噬流障礙，抑或兩者都有。許多早期的研究[12]都通過電鏡或自噬體標志蛋白LC3-Ⅱ水平的增加而得出TBI后自噬體聚積；然而，他們并未提及自噬流。最近，自噬流已在許多TBI動物模型上通過對自噬底物(SQSTM1/P62)水平的檢測加以說明。

P62是一種指引泛素化蛋白進入自噬體進行降解的連接蛋白。P62可伴隨自噬流一并被水解，出現水平降低；相反，當自噬流障礙時，P62水平升高。P62也可被在翻譯水平調節，因此，進一步的研究很有必要弄清其在轉錄、翻譯水平的調節過程。有研究指出TBI動物模型中P62與LC3-Ⅱ水平均升高[14]。

Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)的調節亞基(BECN1/Beclin1)水平增高是自噬體形成的必備條件。在急性局部小腦損傷的小鼠模型中，通過LC3-Ⅱ的一系列檢測表明了自噬流增加[15]。而在體外實驗中，通常是用加和不加自噬抑制劑進行細胞培養(如SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞系)后對比LC3-Ⅱ蛋白水平來研究自噬水平的改變。加自噬抑制劑，如氯喹(chloroquine，CQ，一種溶酶體復合物，可中和溶酶體pH值),Bafilomycin A(V-ATPase 抑制劑)或E-64d/抑胃酶肽A(溶酶體水解酶抑制劑),可使LC3-Ⅱ水平明顯升高[16]。當自噬流被阻斷時，CQ則不能進一步升高LC3水平。用此方法在GFP-LC3轉基因自噬受體鼠中用腦室注射CQ的方式進行研究[15]表明內生的LC3-Ⅱ和神經元的GFP-LC3陽性熒光斑點數量與自噬體數量增加呈正相關，在小腦損傷后這些LC3陽性熒光斑點可進一步增多，用CQ干預后仍可進一步增多。這說明了小腦損傷后自噬流是增加的。

相反，近期關于GFP-LC3小鼠腦震蕩模型的研究指出TBI后小鼠自噬流是抑制的。用Western blotting法和免疫組織化學法均證明了損傷部位周圍自噬體增加伴隨P62水平的升高。通過體內試驗對損傷組和對照組的腦切片在CQ環境下和無CQ環境下的LC3-Ⅱ水平進行檢測，發現CQ增加了對照組中LC3-Ⅱ的水平，但在損傷組中并未增加。在這個模型中，出現了短暫的自噬流抑制(P62水平在TBI后1周恢復)[17]。

出現這種自噬不同的原因并不清楚，這可能是因為損傷模型不同或損傷嚴重程度不同而影響自噬激活或自噬流的程度不同所致。如對于輕度TBI自噬流的激活是一種保護機制。有研究[15]顯示，與正常野生型對照組相比，自噬基因Becn1缺陷鼠的細胞死亡多且功能預后差。另外，許多嚴重的損傷可改變鄰近部位區域自噬體的轉運和降解，引起自噬流障礙。最近一項對人類尸體腦標本的研究[13]顯示，P62在絕大多數標本中都升高，在TBI后生存時間最短的標本中均發現了P62的水平顯著升高，這表明了TBI損傷嚴重程度與P62水平升高程度有關。

2 TBI后參與自噬的相關信號通路改變

在TBI后自噬相關調節機制的研究需要通過應用自噬抑制劑或自噬誘導劑來觀察。然而，絕大多數情況下沒有確切證據證實自噬有確切的信號轉導通路，也沒有準確的體外模型系統來模擬TBI后的腦損傷[18]。

TBI后最常見的關于自噬的機制是BECN1蛋白的增高及BECN1/BCL2復合體的降低，這樣可增加Ⅲ型PI3K的激活以及自噬體的生成。但TBI后BECN1為什么會增高目前仍不清楚。潛在的機制可能是：BECN1蛋白位于細胞膜上，與N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NR2B)形成復合體。TBI可引起BECN1/NR2B復合體解離，釋放BECN1，這可能誘導了自噬。另一個潛在的機制是縫隙連接蛋白43(gap junction protein connexin 43，CX43/GJA1)可直接與BECN1復合體相互作用來調節自噬體的生成[19]。CX43的水平和活性可能影響著TBI后自噬的調節[20]。其他通路還有雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)，氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)[21-22]，然而，他們參與TBI后調節的機制仍需要進一步研究。

3 TBI后自噬與溶酶體

在TBI后自噬流障礙時，大量組織蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)陽性的溶酶體內出現CTSD水平和活性的降低，這說明，TBI可引起溶酶體損傷及功能障礙，這也可能是引起自噬流障礙的原因[17]。研究[23]顯示，與總自噬體數量相比，LC3+/CTSD+自噬體比例下降，說明自噬流障礙，進一步研究需闡明這種自噬體的聚積是因自噬溶酶體的融合過程障礙還是因溶酶體功能整體功能降低有關，抑或兩者都有。

在TBI后溶酶體可能出現損傷的機制仍不清楚。最簡單的解釋就是TBI的機械損傷引起溶酶體膜的完整性破壞。然而，在TBI中并沒有發現可溶性的溶酶體酶滲漏至胞液中[17]。但這并不能排除溶酶體膜受到輕微破壞的可能性。這種局限的溶酶體膜透化(lysosomal membrane permeabilization，LMP)與神經元損傷相關的情況可出現在缺血性腦卒中和神經退行性疾病中[23-24]。潛在的調節因子包括：通過促凋亡的Bcl-2家族蛋白構成通道，分子伴侶熱休克蛋白(heat shock protein 70，HSP70)的抑制和鈣蛋白酶介導的裂解，最終導致溶酶體膜不穩定[25]。BAX和HSP70均參與了TBI后繼發性損傷的過程。溶酶體障礙可引起細胞毒性，但仍需要進一步的研究來闡明TBI后溶酶體損傷的具體機制。

4 TBI后自噬與氧化應激

TBI后另一個與自噬流改變相關的因素是活性氧(reactive oxygen species，ROS)。之前的研究[26-27]顯示ROS在不同的水平和環境下即可促進自噬又可抑制自噬。促進自噬是通過直接通過調節自噬相關蛋白ATG4，或直接調節上游腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]通路來直接促進自噬[28]。而大量的ROS和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)可抑制自噬，如它們可通過亞硝基化JNK的成分及mTOR通路[29]。HSP70在氧化條件下也可被羰基化，可使其更易被鈣蛋白酶裂解。這種導致LMP的機制已在腦缺血中觀察到[30]，在TBI中可能起相同的作用，或者溶酶體膜直接被氧化損傷。因此，ROS和RNS是激活還是抑制自噬流與其水平和損傷的具體機制及程度相關。

5 TBI后自噬與炎性反應

TBI引起一系列的炎性反應可不同程度的激活星形膠質細胞和小膠質細胞，它們激活后會釋放多種細胞因子或炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，擴大神經炎性反應，一系列的炎性反應因子和細胞因子會擴散至正常腦組織，使正常腦組織也受相應的損傷。TBI后自噬與炎性反應之間的關系還存在著爭議，如有研究在小鼠TBI造模后4 h通過給予腹腔注射自噬激活劑雷帕霉素后改善了小鼠的神經功能，減少了小膠質細胞的激活，用藥組的Beclin1水平較對照組輕度升高，說明了自噬增強可能減輕炎性反應[31]。而也有研究[9]得到了相反的結果。而出現這種相反結果的可能是目前仍沒有單一作用的自噬激活劑，也可能是所用動物不同或造模方法不同而導致。仍需進一步的研究來說明。

6 展望

目前關于繼發性腦損傷機制研究的熱點主要集中在自噬炎性反應等方面，在TBI后繼發性腦損傷的機制中關于自噬的研究相對較多，得出的結論仍存在許多爭議[31-34]。關于TBI后自噬的許多重要機制仍未闡明，如TBI后自噬相關蛋白的增高是因為自噬流障礙還是因為自噬增加所致。如果是自噬障礙，是因為溶酶體原因還是因為自噬體與溶酶體融合過程出現了問題?TBI后自噬相關通路是如何變化的?具體哪些通路能怎樣影響自噬?這些通路之間是否存在交互作用以及引起這些變化的原因仍需進一步的研究來闡明。本領域的相關研究大有可為。

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編輯 慕 萌

Research progress in the autophagy related mechanisms in traumatic brain injury

Liu Yuan, Wang Rong*

(CentralLaboratory,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingGeriatricMedicalResearchCenter,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDisease，MinistryofEducation,BeijingInstituteforBrainDisorders,Beijing100053,China)

Traumatic brain injury (TBI) is one of the most important causes of disability of the young people and adults around the world, which caused high mortality and the survivors often accompanied sequelae of physical disability, mental disability and so on. TBI brings a heavy burden to the society development. Autophagy is a hot research field in recent years. Although the study on the mechanism of autophagy changes in the secondary damage induced by TBI has been gradually increasing in recent years, there are still many mechanisms of autophagy to be elucidated. The main aim of this review is to elaborate on the changes of autophagy related mechanism after TBI.

traumatic brain injury；autophagy； autophagy related mechanisms

北京市自然科學基金(7132044)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing(7132044).

時間：2016-12-14 20∶10

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2010.002.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.015]

R 651.1

2016-10-14)

*Corresponding author， E-mail：rong_wang72@aliyun.com