分子生物學技術在胃腸道微生物研究中的應用

湯文杰，唐　凌，張　純，鄺聲耀*（四川省畜牧科學研究院動物營養研究所，四川省飼料科技研發中心，四川 成都 610066）

分子生物學技術在胃腸道微生物研究中的應用

湯文杰，唐凌，張純，鄺聲耀*
（四川省畜牧科學研究院動物營養研究所，四川省飼料科技研發中心，四川 成都 610066）

摘要：本文論述了末端限制性片段長度多態性（T-RLFP）技術、變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術、熒光原位雜交（FISH）技術、實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術、基因芯片（Gene chip）技術及高通量測序（HTS）技術等多種分子生物學技術在胃腸道菌群研究方面的應用。

關鍵詞：胃腸道微生物；末端限制性片段長度多態性；變性梯度凝膠電泳；熒光原位雜交；實時熒光定量PCR；基因芯片；高通量測序

近年來，隨著分子生物學技術的成熟與發展，動物胃腸道微生物研究技術步入了一個新的階段。現代分子生物學技術無論從質量上還是數量上都能更加精確地揭示微生物種類和遺傳的多樣性。本文就近年來國內外分子生物學技術在動物胃腸道微生物研究中的應用進展作一綜述。

1　分子生物學研究方法

1.1末端限制性片段長度多態性（T-RLFP）技術T-RFLP技術以分子系統學原理為基礎，綜合運用了PCR、限制性酶切、熒光標記和DNA序列分析等技術，通過對特定核酸片段長度多態性的測定來分析微生物群落結構和功能。T-RFLP的原理：采用一端熒光標記的引物進行PCR，擴增全長16S rRNA基因，然后用合適的限制性內切酶消化PCR產物，產生不同長度特征的限制性片段。酶切后的產物用DNA測序儀進行分析，通過掃描得到含有熒光標記的片段，而沒有標記熒光的片段無法識別，所以不能顯示，最后通過分析，揭示樣品種類、數量和種群大小等信息，從而解析群落結構、功能及動態變化。雖然該技術已被證明是一種監測胃腸道微生物群落的有用的指紋圖譜技術，但是仍然存在局限性：（1）擺脫不了PCR技術共同的缺陷，如不同菌種DNA的差異性擴增，以及目標DNA在菌種間拷貝數的差異等；（2）T-RFLP圖譜中每個TRF有可能不只對應一個菌種，造成對群落多樣性的低估；（3）酶切后TRF的長度分布也會造成對復雜群落多樣性的低估，因為測序儀檢測500bp以上的TRF的精度不夠；（4）實驗過程影響因素眾多，使得T-RFLP圖譜的解析存在一定的不確定性；（5）在如何對大量T-RFLP數據進行處理和統計學分析，以挖掘出其中的群落結構信息方面，很多理論和技術上的問題仍處于摸索階段。

1.2變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術DGGE技術的原理：堿基序列存在差異的不同等長DNA在同一含有變性劑的凝膠中進行電泳，會表現不同的電泳速度，因此通過對DNA染色可將不同的DNA區分開。DGGE技術一直不斷的發展，隨后出現了溫度梯度凝膠電泳（TGGE）技術、瞬時溫度梯度凝膠電泳（TTGE）技術等，DGGE及其相關技術已被應用到人類、豬、牛、狗和嚙齒動物等物種的微生物生態系統研究上，揭示了動物年齡、日糧成分、益生菌以及抗生素對腸道細菌群體的影響。DGGE作為一種分子生物學技術，除擁有多數分子生物學技術所共有的缺點外（即PCR過程中會產生偏差），還有一些自身的缺陷：（1）DGGE只能分離1 000 bp以下的DNA片段，只能夠提供有限的系統發育信息；（2）如果實驗條件不恰當，梯度不合適，會使序列不同的DNA遷移到膠的同一位置；（3）PCR-DGGE的指紋圖譜上通常僅顯示微生物群落中的優勢種群，所以只能對菌體數量大于總菌量1%的菌群進行分析。雖然DGGE技術存在不少缺點，但它可直接利用DNA或者RNA對微生物遺傳特征進行表征，不但避免了傳統上耗時的菌種分離，直接再現微生物群落的遺傳多樣性和動態性，更可與16S rDNA基因序列分析結合，鑒定出無法利用傳統方法分離的菌種，因而成為胃腸道微生物研究的新寵。

1.3熒光原位雜交（FISH）技術FISH技術的原理：根據已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環境基因組中DNA分子雜交，從而檢測該特異微生物種群的存在與豐度。FISH相對其他技術的優點是無需培養和核酸提取、PCR擴增等程序，能夠定量和自動化，可以描述微生物的形態特征、豐度以及在樣品上的空間分布和動態。目前，研究者已經設計出許多不同細菌的特異性探針。應用此技術，一組15個的FISH探針就能夠檢測到約90%的人類常規腸道微生物。實際上，FISH技術仍然存在一些不足：（1）從研究對象來看，FISH技術只能面向已知序列的微生物進行研究；（2）細菌普遍存在自發熒光現象且靈敏度較低，容易導致假陽性結果。所以，FISH技術還需要與其他分子生物學技術結合使用，才能達到更好的效果。

1.4實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術RT-PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光物質，通過RTPCR檢測系統對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監測，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。由于該方法高效、準確的定量特性，目前已成功用于對人類、仔豬腸道及反芻動物瘤胃中某些特定菌群的定量分析。RT-PCR技術延續和發展了普通PCR的敏感性和特異性，同時克服了普通PCR不能精確定量、容易污染的不足。當然，RT-PCR尚存在一些不足之處：（1）熒光素種類及檢測光源的局限性會不同程度地限制RT-PCR的復合式檢測應用能力；（2）該技術只能對少數目標種類進行測定，對于研究復雜的生態系統，此技術便非常費時費力，因為每種細菌都需要特定的引物與PCR擴增條件。目前，在豬的腸道微生物研究方面，研究者已經設計了各種引物能夠對總細菌、乳酸菌、鏈球菌和雙歧桿菌等進行定量檢測。所以，用該技術對腸道菌群進行研究時，還需要與其他分子生物學技術相結合，從而定性、定量地研究微生物區系的變化，深入了解微生物菌群與環境之間的相互作用及其動態變化過程，為全面、快速、準確分析和鑒定復雜環境中的微生物菌群提供了一種新的技術手段。

1.5基因芯片（Gene chip）技術Gene chip技術是采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量DNA探針如基因、PCR產物和人工合成的寡核苷酸等有序地固定在載體表面，形成儲存大量信息的高密度DNA微陣列，該微陣列與標記的核酸樣品雜交后，能快速、準確、大規模地獲取樣品核酸序列信息，從而應用于各種生態系統的菌群研究。Wang等較早建立了人胃腸道40種主要細菌的芯片鑒定技術，包括擬桿菌、梭菌屬、瘤胃球菌、真桿菌、梭形桿菌、乳酸桿菌、球桿菌、大腸桿菌等，發現其中33種細菌都能通過此方法檢測到。在研究人類結腸和胃微生物生態系統時，所設計芯片中的探針能檢測到359個微生物物種和316個新的OTUs。最近由Oleg等制備出的基因芯片則更為靈敏，可檢測出人類腸道中775個微生物物種。近年來，這項技術正廣泛應用于病原微生物的檢測研究。當然，基因芯片技術研究體系仍然存在一定的提升空間，比如提高芯片的特異性、增加信號檢測的靈敏度，這些都可以為腸道菌群的研究提供更為廣闊的應用前景，從而推動該領域研究達到一個新的高度。

1.6高通量測序（HTS）技術HTS技術的原理：在焦磷酸測序的反應體系中會存在4種酶，分別為DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應底物為5′-磷酰硫酸以及熒光素，在反應體系中還包括待測序DNA單鏈和測序引物。當引物與模板DNA復性后，在上述4種酶的協同作用下，每一個dNTP的聚合會與一次熒光信號的釋放偶聯起來，最終以熒光信號的形式實時記錄模板DNA的核苷酸序列。隨著HTS技術的發展，宏基因組技術開始被用于研究人類及動物胃腸道微生物群落的結構和功能。2006年，Gill等首次對兩個健康人的微生物宏基因組進行了比較，并提出了“Superorganism”概念。Ziemer取豬糞便，加纖維素、果膠木聚糖連續培養8周后，利用基于高通量測序的宏基因組技術得到575種細菌菌株，與核糖體數據庫比對后，約有30%的細菌為不可培養菌，有179株屬于新的菌種或菌屬。通過高通量測序技術對動物腸道微生物進行測序，然后比對數據庫，可準確獲得腸道微生物群落的分類、豐度信息，確定這些腸道微生物的主要功能，為后續動物腸道研究提供支持。

雖然高通量測序技術相對于傳統研究方法而言在獲得微生物數據量、可操作性等方面具有很大進步，但仍不夠完善。比如，現在的高通量測序技術都是將DNA剪切為小片段后，再單個連接至一定的固相表面單獨擴增后拼接并檢測信號，DNA拼接越長難度越大，因而難以完全控制完美的片段閾值，存在一定的誤差。另一方面，高通量測序越來越強的測序深度及越來越大的數據輸出也導致現有算法難以完全利用如此龐大的數據量，不但造成數據的浪費且在一定程度上制約了高通量測序技術在宏基因組學方面的應用。此外，該方法的費用非常高。不可否認，高通量測序技術第一次使人類得以研究占環境中99%的不可培養的微生物種群，進一步拓展了人類研究腸道菌群的深度和廣度，但該方法的費用不菲，不利于廣泛推廣。

2　分子生物學方法存在的問題

分子生物學方法較傳統方法有不可替代的優勢，但也存在著許多問題：

2.1樣品保存問題環境樣品在提取核酸前的厭氧和常溫存放不可避免地導致樣品中微生物發生變化，冷凍可以減緩變化過程，但是存放時間也不可以過長，某些微生物在0～4℃仍然可以觀測到明顯的生長現象。

2.2樣品DNA的質量問題一般糞便樣品中除腸道微生物外，還有腐殖質、動物腸道脫落細胞及碎片、各種無機物和有機物等，如何獲取高質量、較完整的腸道菌群基因組DNA是腸道微生物研究的基礎。

2.3DNA純化問題微生物與環境中的有機物結合緊密，對高效率提取核酸造成了困難；樣品中存在的腐殖酸對DNA的檢測和定量也有很大的影響，主要表現在抑制DNA高溫聚合酶的活性，干擾限制酶的結合位點，降低轉化效率以及DNA雜交的特異性。

3　小結

分子生物學方法可以讓我們更深入地了解腸道微生物群落的結構、多樣性和功能等，由于每種研究微生物的技術都有一定的優勢和局限性，故實際研究過程中經常采取多種方法相結合的手段。■

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中圖分類號：S818.9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-8964（2016）06-0027-03

收稿日期：2016-02-24

基金項目：四川省公益性科研院所基本科研業務費項目（SASA2013A05）

作者簡介：湯文杰（1984-），男，四川南充人，碩士研究生，主要從事動物營養研究與飼料添加劑開發。

*通訊作者：鄺聲耀，研究員。

Application of Molecular Biological Technology in the Study of Gastrointestinal Microflora

TANG Wenjie，TANG Ling，ZHANG Chun，et al.
（Institute of Animal Nutrition，Sichuan Animal Science Academy，Sichuan Feed Scientific Research and Development Center，Sichuan Chengdu 610066，China）

Abstract：This paper focused on the application of some modern molecular biotechnology in the study of gastrointestinal microorganism，including terminal-restriction fragment length polymorphism（T-RFLP），denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE），fluorescence in situ hybridization（FISH），real-time polymerase chain reaction（RT-PCR），gene chip and high-throughput sequencing（HTS）technology etc.

Key Words：Gastrointestinal microflora；T-RLFP；DGGE；FISH；RT-PCR；Gene chip；HTS