豬瘟流行病學(xué)及診斷方法研究進(jìn)展

陳　強(qiáng)，梁禮南2（.廣西壯族自治區(qū)桂平市江口鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 桂平 537229；2.廣西壯族自治區(qū)玉林市安勝動物科技有限公司，廣西 玉林 537000）

豬瘟流行病學(xué)及診斷方法研究進(jìn)展

陳強(qiáng)1，梁禮南2
（1.廣西壯族自治區(qū)桂平市江口鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 桂平 537229；2.廣西壯族自治區(qū)玉林市安勝動物科技有限公司，廣西 玉林 537000）

摘要：本文從豬瘟流行病學(xué)及診斷學(xué)等方面闡述了豬瘟目前的流行特點(diǎn)及其診斷方法的研究進(jìn)展，為基層動物防疫工作人員充分了解該病提供參考。

關(guān)鍵詞：豬瘟；流行病學(xué)；診斷方法

為了充分認(rèn)識豬瘟的流行現(xiàn)狀，促進(jìn)防控工作有效開展，本文就豬瘟的流行、診斷方法等進(jìn)行綜述。

1　豬瘟流行病學(xué)

1.1臨床發(fā)病特點(diǎn)

1.1.1呈散發(fā)性流行且發(fā)病表現(xiàn)溫和。當(dāng)前豬瘟的流行形勢從頻繁發(fā)生的大流行性轉(zhuǎn)為地區(qū)性、散發(fā)性流行。在發(fā)病表現(xiàn)上，既有高死亡率的急性、典型豬瘟，又有持續(xù)感染的溫和型、非典型豬瘟，還有無名高熱或隱性豬瘟。

1.1.2發(fā)病日齡偏小。仔豬發(fā)病急，病死率高，特別是斷奶前后和出生10日齡以內(nèi)的仔豬較為多見。成年豬發(fā)病較輕或耐過（隱性帶毒），病理變化不明顯，需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測確診。

1.1.3與其他疾病混合感染的現(xiàn)象比較普遍。豬瘟常與藍(lán)耳病、偽狂犬病、豬肺疫、弓形蟲病、豬丹毒等病混合感染，并多繼發(fā)鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病、氣喘病、附紅細(xì)胞體病及仔豬副傷寒等［1］，導(dǎo)致病情復(fù)雜，給診斷和治療帶來了很大難度。

1.2病毒基因型據(jù)報道，目前我國流行的豬瘟病毒基因型主要為基因2群，占74.66%，基因1群只占25.34%，而我國的豬瘟兔化弱毒疫苗株為基因1群［2］。可見豬瘟病毒基因型已發(fā)生重大變化。

1.3豬瘟病毒的主要儲存宿主種豬持續(xù)感染且?guī)Ф臼俏覈i瘟難控制的重要原因，種豬已成為豬瘟病毒的主要儲存宿主。目前，在實(shí)驗(yàn)室條件下已首次成功地利用豬瘟野毒人工復(fù)制帶毒母豬動物模型，此母豬可帶毒750d，甚至可以終生帶毒、排毒，血液中的含毒量可達(dá)到105～106PFU/mL。利用該模型的帶毒母豬自然交配或人工授精，可使使其產(chǎn)下帶毒仔豬，用健康陰性豬與之同居，會造成同居豬感染。另外，利用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒的基因型，發(fā)現(xiàn)帶毒公豬的病毒基因型與其自然交配所產(chǎn)死胎的病毒基因型是一致的，說明豬瘟病毒能通過公豬精液垂直傳播。

1.4豬瘟免疫目前有些豬場經(jīng)常出現(xiàn)免疫過了豬瘟疫苗還是有豬瘟發(fā)生的問題，分析免疫失敗的原因，可能存在以下情況：（1）種豬存在持續(xù)感染和帶毒現(xiàn)象，導(dǎo)致出生仔豬往往成為持續(xù)感染者，這種感染豬不能建立中和性抗體應(yīng)答，形成免疫耐受；（2）圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒和豬藍(lán)耳病病毒的混合感染可造成豬瘟病毒在體內(nèi)滯留而形成持續(xù)感染，影響豬瘟疫苗的免疫效果；（3）由于我國豬瘟疫苗中的病毒含量比國際標(biāo)準(zhǔn)差得遠(yuǎn)，免疫劑量不足而易導(dǎo)致免疫失敗。

2　診斷方法

目前，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)原理建立了許多豬瘟檢測方法，概括起來可分為三大類，分別為病原學(xué)方法、血清學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。

2.1病原學(xué)方法對CSFV的直接分離鑒定是診斷豬瘟最為經(jīng)典可靠的方法。取疑似病豬的組織如扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)等經(jīng)過一些處理后接毒于PK-15細(xì)胞或豬睪丸細(xì)胞上培養(yǎng)，然后用CSF免疫熒光抗體法或免疫酶染法檢查，可檢測出細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞漿內(nèi)的病毒抗原，亦可將分離的病毒回歸到健康豬體內(nèi)，出現(xiàn)豬瘟的典型癥狀即可確診［3-4］。病毒分離鑒定方法特異性高，是診斷CSFV最為可靠的方法，但耗時較長、成本高，不易在臨床中推廣，比較適合科研院校研究用。

2.2血清學(xué)方法

2.2.1熒光抗體試驗(yàn)（FAT）。熒光抗體試驗(yàn)就是從高效價的特異性免疫血清提取IgG并熒光標(biāo)記，然后利用抗原抗體特異性反應(yīng)的原理，通過觀察是否有熒光出現(xiàn)來判斷是否有相應(yīng)抗原存在的一種靈敏而又特異的診斷方法。豬瘟熒光抗體檢測是目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室診斷豬瘟最常用的方法。許多國家和地區(qū)將冰凍組織切片或觸片的直接熒光抗體試驗(yàn)作為執(zhí)行消滅豬瘟規(guī)劃的法定診斷方法。可用FAT直接檢測扁桃體、脾臟、腎臟和回腸遠(yuǎn)端冰凍切片中的抗原，尤以發(fā)病早期的扁桃體的檢出率較高，也可將豬扁桃體和脾制成20g/L的混合勻漿后接種到無豬瘟病毒污染的豬源細(xì)胞（如PK-15）上，24～72h后進(jìn)行飛片F(xiàn)AT試驗(yàn)，檢查細(xì)胞中是否存在CSFV。此種病毒分離診斷方法比冰凍組織切片更為敏感。此試驗(yàn)需要注意消除非特異性染色，設(shè)置已知陰性和陽性標(biāo)本以及熒光抑制試驗(yàn)等條件，以提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確率。戴愛玲［5］利用熒光抗體技術(shù)對20頭不同病程的可疑病豬病料樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該技術(shù)在豬瘟病毒感染早期的檢出率較高，不僅能檢出強(qiáng)毒抗原，還能檢出低毒力病毒感染的帶毒母豬。

2.2.2間接血凝試驗(yàn)（IHA）。間接血凝試驗(yàn)是利用CSFV或豬瘟免疫血清純化的IgG致敏綿羊紅細(xì)胞，將待檢血清或病原梯度稀釋后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)紅細(xì)胞的凝集情況判斷結(jié)果。利用CSFV致敏綿羊紅細(xì)胞的間接血凝試驗(yàn)稱為正向間接血凝試驗(yàn)，利用豬瘟免疫血清純化的IgG致敏綿羊紅細(xì)胞的試驗(yàn)則稱為反向間接血凝試驗(yàn)。正向間接血凝試驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地測出抗體效價，具有簡便、快捷、易操作的特點(diǎn)，目前在基層中使用廣泛［6］，但不能區(qū)分是否為野毒感染。由于紅細(xì)胞容易產(chǎn)生血凝現(xiàn)象，診斷液還容易因?yàn)榧t細(xì)胞處理不當(dāng)而產(chǎn)生非特異性的血凝現(xiàn)象，所以在實(shí)際應(yīng)用中容易出現(xiàn)結(jié)果偏差。反向間接血凝試驗(yàn)?zāi)軌驒z測組織病料如脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體中的CSFV抗原，但由于對組織病料的處理方法有差異，而且組織中的血細(xì)胞易造成干擾和非特異凝集，使得結(jié)果判定困難，因而現(xiàn)在已很少應(yīng)用。

2.2.3酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附劑法是指將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或酶聯(lián)免疫測定儀判斷結(jié)果的一種方法［7］。該法敏感性強(qiáng)、特異性高、檢測速度快、易于標(biāo)準(zhǔn)化，是當(dāng)前應(yīng)用最廣的一項(xiàng)檢測技術(shù)。根據(jù)ELISA所用的固相載體不同可分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）；再一類是采用疏水性聚酯布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗夾心ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。目前用于檢測豬瘟抗體的ELISA方法主要有間接ELISA和阻斷ELISA。蔣卉等［8］通過比較14種國內(nèi)外豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的符合率，發(fā)現(xiàn)6種阻斷ELISA試劑盒的符合率均可達(dá)到100%，在敏感性和特異性上整體優(yōu)于另外8種間接ELISA試劑盒。雙抗夾心ELISA法、夾心ELISA法及競爭ELISA法主要是檢測豬瘟病毒抗原［9-11］。

另外，有學(xué)者利用CSFV特異性單抗和ELISA原理建立了區(qū)分豬瘟強(qiáng)、弱毒的ELISA抗體檢測方法。丘惠深等［12］制備了CSFV石門株和弱毒疫苗株特異性單抗，并用親和層析法將兩種單抗分別制成單抗酶聯(lián)診斷試劑。強(qiáng)毒單抗酶聯(lián)診斷試劑可用于豬瘟的疫病監(jiān)測，為凈化豬場提供依據(jù)；弱毒單抗酶聯(lián)診斷試劑可用于監(jiān)測豬瘟疫苗免疫抗體，以準(zhǔn)確評估群體免疫水平，考察豬群的免疫效果。這兩種單抗酶聯(lián)診斷試劑的應(yīng)用，為豬瘟抗體的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。鄭世軍等［13］、郭振梅等［14］、李育林等［15］、陳振華［16］都用該單抗酶聯(lián)試劑對臨床血清樣品進(jìn)行了檢測，取得了較滿意的效果。

2.2.4膠體金免疫層析試驗(yàn)。膠體金技術(shù)是20世紀(jì)80年代繼熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記和酶標(biāo)記三大標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)，具有操作簡單、方便快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合基層獸醫(yī)使用。其原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)層析作用，使抗原、抗體在固相膜上反應(yīng)，以膠體金為標(biāo)記物，陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色，陰性反應(yīng)則不顯色。國內(nèi)近年來也在豬瘟診斷上研究成功了許多診斷試紙條，如直接檢測豬瘟抗原的診斷試紙條和檢測豬瘟抗體的診斷試紙條。

2.3分子生物學(xué)方法自1983年KaryMullis發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）以來，PCR技術(shù)就以其簡便、迅速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)在分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用，同樣在豬瘟病毒檢測上也有了廣泛應(yīng)用。比如RT-PCR技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)等。RT-PCR是一種以病毒RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來檢測病毒的方法。陳本龍等［17］成功建立了一種能夠區(qū)分豬瘟病毒強(qiáng)毒株和HCLV株的RT-PCR檢測方法。該法從豬瘟強(qiáng)毒株和兔化弱毒株中擴(kuò)增出了大小分別為680bp和785bp的特異性片段，具有高度的特異性和敏感性。實(shí)時熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，為豬瘟病毒的定量檢測提供了新的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）方法是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增新技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。張改平等［18］建立的豬瘟強(qiáng)弱毒LAMP檢測方法，特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1000倍，且重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，為快速準(zhǔn)確地鑒別CSFV野毒感染和疫苗接種感染提供了有效的方法。

3　小結(jié)

目前豬瘟的流行已經(jīng)由以前的大流行轉(zhuǎn)變成散發(fā)或地方性流行，發(fā)病日齡也逐漸變小，更嚴(yán)重的是種豬的隱性感染易導(dǎo)致豬瘟持續(xù)存在，加之易與其他疾病混合感染，使得豬瘟防控的任務(wù)十分艱巨。豬瘟弱毒疫苗在我國的大規(guī)模應(yīng)用使得豬瘟強(qiáng)毒、疫苗弱毒的鑒別診斷成為有效防控豬瘟的攔路虎。雖然現(xiàn)在建立了許多鑒別強(qiáng)、弱毒的檢測方法，但能顯示出巨大發(fā)展?jié)摿蛷V闊應(yīng)用前景的應(yīng)該是基于單克隆抗體的膠體金免疫層析試驗(yàn)。該方法具有簡單、快速，不需特殊儀器、可肉眼判別的優(yōu)點(diǎn)，非常適合基層獸醫(yī)部門和廣大養(yǎng)殖戶使用。■

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中圖分類號：S852.651

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-8964（2016）06-0030-03

收稿日期：2016-05-05

作者簡介：陳強(qiáng)（1979-），男，廣西桂平人，助理獸醫(yī)師，本科，主要從事動物臨床、動物疫病預(yù)防控制工作。

Research on the Progress of Epidemiology and Diagnosis Method of Classical Swine Fever

CHEN Qiang1，LIANG Linan2
（1.Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station of Jiangkou Town in Guiping City，Guangxi Guiping 537229；
2.Ansheng Animal Science and Technology Limited Company in Yulin City，Guangxi Yulin 537000，China）

Abstract：In this paper，we reviewed the latest progress of epidemiology and diagnosis method of CSF，in order to provide a reference for animal epidemic prevention staffs understanding CSF.

Key words：Classical swine fever（CSF）；Epidemiology；Diagnosis method