多重PCR 技術(shù)在豬病檢測(cè)中的應(yīng)用

馬　銳，黃小波，楊國(guó)淋，滑　翔，趙玉佳（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，豬病研究中心與基因芯片實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

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多重PCR 技術(shù)在豬病檢測(cè)中的應(yīng)用

馬銳，黃小波*，楊國(guó)淋，滑翔，趙玉佳
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，豬病研究中心與基因芯片實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

摘要：多重PCR技術(shù)是一種實(shí)用的分子診斷技術(shù)，該技術(shù)能在同一反應(yīng)體系中同步擴(kuò)增多個(gè)目的片段，具有高效、快捷、敏感、特異等優(yōu)勢(shì)，適用于對(duì)大量臨床樣本的快速檢測(cè)。本文就多重PCR的技術(shù)原理、在豬病檢測(cè)中的技術(shù)類型（常規(guī)技術(shù)、分型技術(shù)、創(chuàng)新技術(shù)）等進(jìn)行了敘述。

關(guān)鍵詞：多重PCR；豬病；檢測(cè)；應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外酶促合成反應(yīng)，可以大量擴(kuò)增特定的DNA序列，是常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，近年來(lái)已滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。隨著PCR技術(shù)的廣泛研究與應(yīng)用，由基本的PCR原理衍生出的新技術(shù)已不斷出現(xiàn)，其中多重PCR技術(shù)在病原診斷中具有重大的意義。

1　多重PCR技術(shù)的基本原理

多重PCR技術(shù)是PCR技術(shù)的一種，由Chamberian等在1888年率先報(bào)道。該技術(shù)具有高度特異性、敏感性、高效快捷、實(shí)驗(yàn)成本低、實(shí)驗(yàn)進(jìn)程快等優(yōu)點(diǎn)，并迅速在人類、動(dòng)物以及微生物研究方面得到廣泛應(yīng)用。其原理與PCR技術(shù)原理基本一致，指在同一反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或多對(duì)特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因或DNA序列。在各種生物基因組中存在連續(xù)的20～30個(gè)相同或者互補(bǔ)堿基的概率幾乎不存在，并且DNA聚合酶具有非常高的復(fù)制準(zhǔn)確活性。所以在多重PCR反應(yīng)體系中，由各引物交叉結(jié)合而造成的非特異性擴(kuò)增的可能性十分小，保證了多重PCR的特異性。多重PCR不但可同時(shí)擴(kuò)增多條目的片段，節(jié)省了試劑和時(shí)間，而且減少了污染的機(jī)會(huì)。理論上只要條件允許，引物對(duì)的數(shù)量可以不限，目前有擴(kuò)增8條目的片段的記錄。但該技術(shù)需要對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行多次優(yōu)化。

2　多重PCR技術(shù)在豬病檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1多重PCR用于常規(guī)豬病診斷

2.1.1病毒常規(guī)檢測(cè)焦洋等［1］根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）S基因序列、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）M基因和豬博卡病毒（PBoV）NP1基因序列，設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物，建立了檢測(cè)TGEV、PEDV 和PBoV的多重PCR方法，用該方法檢測(cè)60份臨床樣品，得出TEGV陽(yáng)性率為1.6%，PEDV陽(yáng)性率為6.7%，PBoV陽(yáng)性率為21.7%。Xu等［2］建立了檢測(cè)圓環(huán)病毒2型（PCV2）、偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV）、藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、乙型腦炎病毒（JEV）的多重PCR，該技術(shù)可同時(shí)鑒別診斷6種常見(jiàn)病毒病，且對(duì)各類病毒的靈敏度均高于普通PCR，各引物之間沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性高。Ogawa等［3］建立了可檢測(cè)蓋塔病毒（GETV）、TGEV、豬輪狀病毒A型（GAR）、PEDV、JEV、PRRSV、PPV、豬水泡病毒1型（SuHV-1）和PCV2的8重PCR檢測(cè)方法，使用該方法檢測(cè)75份臨床樣本，其檢測(cè)結(jié)果與普通PCR的結(jié)果相一致，表明該方法具有良好的靈敏性和特異性。

2.1.2細(xì)菌常規(guī)檢測(cè)Rossi等［4］基于SCAR片段建立的三重PCR可準(zhǔn)確鑒別診斷胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌以及多殺性巴氏桿菌，該方法與普通PCR結(jié)果相一致，對(duì)臨床疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。李偉杰等［5］分別針對(duì)志賀毒素Stx2eA亞基、大腸埃希菌16S rDNA和菌毛F18ab A亞基的保守序列設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物，優(yōu)化并建立了多重PCR，結(jié)果與其他豬常見(jiàn)致病菌均無(wú)交叉反應(yīng)。該方法對(duì)豬水腫病大腸埃希菌的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有一定的應(yīng)用價(jià)值。安俊卿等［6］根據(jù)沙門菌hut基因、多殺性巴氏桿菌kmt1基因和大腸埃希菌23S rRNA基因設(shè)計(jì)并合成3對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了多重PCR方法，結(jié)果對(duì)沙門菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌的最低檢出量分別為1.77×104CFU/mL、1.88×104CFU/mL、2.01×104CFU/mL。該方法特異性強(qiáng)、敏感度高、穩(wěn)定性好，能從混合感染的病料中檢測(cè)出3種病原菌。

2.2多重PCR用于豬病分型鑒別

2.2.1病毒的分型鑒定王曉波等［7］根據(jù)GenBank中公布的已知序列對(duì)CSFV、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）及經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征病毒（C-PRRSV）分別設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化并建立了多重RT-PCR方法，結(jié)果顯示可用2對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)這3種病毒。徐磊等［8］根據(jù)豬圓環(huán)病毒1型（PCV-1）、圓環(huán)病毒2型a（PCV-2a）以及圓環(huán)病毒2 型b（PCV-2b）序列的差異設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了三重PCR方法，結(jié)果表明該方法靈敏性高、引物特異性良好，各引物之間沒(méi)有出現(xiàn)交叉反應(yīng)。用此方法對(duì)采集自陜西省的56份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與單重PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)88%以上。

2.2.2細(xì)菌的分型檢測(cè)Liu Z等［8］利用全基因組高通量測(cè)序設(shè)計(jì)特異性引物，完成了多重PCR的建立，用該方法對(duì)鏈球菌進(jìn)行鑒別診斷，結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)4次多重PCR，成功鑒別出了33種血清型。張亮等［10］根據(jù)JEV基因I型和基因III型的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了多重RTPCR方法，用該法檢測(cè)27份臨床樣品，結(jié)果靈敏且特異性地檢測(cè)出了5份為基因I型，2份為基因III型，與核苷酸序列分析結(jié)果一致。

2.3多重PCR與其他技術(shù)的創(chuàng)新結(jié)合

2.3.1與熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合王乃福等［11］根據(jù)口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白編碼基因、水皰性口炎病毒（VSV）N蛋白編碼基因和豬水泡病病毒（SVDV）VP1蛋白編碼基因的高保守區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，成功建立了可同時(shí)檢測(cè)這三種病毒的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果經(jīng)擴(kuò)增顯示，該方法靈敏度高，特異性良好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒混合感染的同時(shí)檢測(cè)。Zhao等［12］結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)與多重PCR技術(shù)成功地建立了一種快捷高效的熒光定量多重PCR檢測(cè)方法，用于鑒別豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的經(jīng)典株和變異株。該方法針對(duì)PEDV保守序列中的S基因設(shè)計(jì)兩套引物，可對(duì)不少于5×102DNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。使用該方法檢測(cè)42份臨床腹瀉病料，其中36份為變異毒株，3份為經(jīng)典毒株。

2.3.2與不對(duì)稱PCR和懸浮陣列技術(shù)結(jié)合Chen等［13］結(jié)合不對(duì)稱PCR技術(shù)、懸浮微陣列技術(shù)以及多重PCR技術(shù)，成功建立了一種可同時(shí)檢測(cè)PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV的診斷方法。用該方法檢測(cè)218份臨床病料，檢測(cè)率均高于RT-PCR和不對(duì)稱PCR，且從提取病毒核酸到顯示檢測(cè)結(jié)果只需2h。

2.3.3與LAMP技術(shù)結(jié)合Park等針對(duì)引起豬增生性腸病的胞內(nèi)勞森氏菌的不同基因設(shè)計(jì)了4段引物，將多重PCR與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）相結(jié)合，所建立的新方法特異性強(qiáng)，靈敏性是RT-PCR的10～100倍，同時(shí)節(jié)約了試劑成本和檢測(cè)時(shí)間。

2.3.4與基因芯片技術(shù)結(jié)合王小強(qiáng)等［14］針對(duì)PCV-2、PPV、PRV、SIV、CSFV、FMDV和PRRS建立的多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增方法與寡核苷酸基因芯片相結(jié)合，雜交反應(yīng)中使用膠體金進(jìn)行標(biāo)記，最后用銀染試劑進(jìn)行顯色，建立了可同時(shí)檢測(cè)7種常見(jiàn)豬病的可視化寡核苷酸基因芯片，其檢測(cè)結(jié)果與普通PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。基于多重PCR技術(shù)的寡核苷酸可視化基因芯片，具有靈敏性高、節(jié)約費(fèi)用和省時(shí)等優(yōu)良特性。

3　多重PCR技術(shù)的應(yīng)用前景

多重PCR技術(shù)以其快速、高效、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)在病原檢測(cè)方面與流行病學(xué)調(diào)查方面具有重要作用［15］。多重PCR在反應(yīng)過(guò)程中可能存在多對(duì)引物之間的相互抑制，引物與非靶序列結(jié)合可能產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，因此在確立多重PCR實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，首先應(yīng)合理設(shè)計(jì)引物，同時(shí)重視優(yōu)化反應(yīng)體系中的主要成分和反應(yīng)條件，以減少非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性。除此之外，多重PCR作為一種靈敏快速、高通量的特異性擴(kuò)增技術(shù)常常與其他方法結(jié)合使用，如在硅玻基片中完成系列核酸擴(kuò)增反應(yīng)的多重PCR基因芯片技術(shù)、LAMP技術(shù)、實(shí)時(shí)多重PCR技術(shù)、巢式多重PCR、熒光定量多重PCR等。但其在實(shí)際應(yīng)用中也存在不少問(wèn)題，一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；且反應(yīng)為多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，若各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性等非理想結(jié)果。

多重PCR技術(shù)在今后病原檢測(cè)中的研究應(yīng)用仍需要改善。首先，為增加檢測(cè)病原數(shù)量，可進(jìn)一步增加反應(yīng)體系中的引物對(duì)，以拓寬一次擴(kuò)增反應(yīng)所能檢測(cè)的范圍。同時(shí)，未來(lái)應(yīng)重點(diǎn)檢測(cè)疫苗株和變異株，做流行病學(xué)調(diào)查，為疾病防治做準(zhǔn)備。其次，多重PCR應(yīng)與其他技術(shù)結(jié)合，以提高檢測(cè)敏感性和特異性，縮短檢測(cè)時(shí)間。最后，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的管理等。

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Application of Multiplex PCR in Detection of Swine Disease

MA Rui，HUANG Xiaobo，YANG Guolin，et al.
（Veterinary Medicine College of Sichuan Agricultural University，Swine Diseases Research Center and Gene Microarray Lab，Sichuan Chengdu 611130，China）

Abstract：As a rapid，efficient，high-specificity and sensitivity method to amplified fragments in a single reaction，multiplex PCR technology is suitable for detection and analysis of large numbers of clinical samples. In this article，the fundamental and technological type in swine diseases detection of multiplex PCR （conventional detection，identification technology，creative technology）were described detailedly.

Key words：Multiplex PCR；Swine disease；Detection；Application

中圖分類號(hào)：S818.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-8864（2016）05-0031-03

收稿日期：2016-02-25

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)項(xiàng)目“新型動(dòng)物疫病診斷技術(shù)應(yīng)用”（201203056）

作者簡(jiǎn)介：馬銳（1888-），男，四川成都人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病研究。E-mail：iwanttogetsci@163.com

*通訊作者：黃小波，教授。E-mail：rsgh110@126.com