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淺談禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)注意事項(xiàng)

2016-04-05 17:10:42
獸醫(yī)導(dǎo)刊 2016年8期
關(guān)鍵詞:血清

牛 剛

淺談禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)注意事項(xiàng)

牛 剛

(河北省涿州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北涿州 072750)

禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)可用于血清中抗體水平的監(jiān)測,也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)。這兩種試驗(yàn)在實(shí)踐中應(yīng)用的比較多,但也容易出錯,現(xiàn)對該試驗(yàn)過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)做一探討。

禽流感血凝;血凝抑制試驗(yàn);移液槍;保存

1 樣品的保存及試驗(yàn)前處理

(1)采集的血液樣品應(yīng)及時分離血清,離心后吸出血清,對應(yīng)編號冷藏送檢,并禁止運(yùn)輸過程中劇烈震動。

(2)一般情況下,在5d內(nèi)檢測的樣品可放置在4℃的冰箱中冷藏,待檢血清超過1周的需低溫冷凍保存。

(3)在檢測前血清樣品應(yīng)充分混勻,混勻時采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可,切忌劇烈振蕩而引起產(chǎn)生氣泡。

(4)對出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品,要反復(fù)攪動幾下再離心有助于緩解該狀態(tài)。可能是由于放置時間不夠造成的血清未完全析出,不建議直接吸取其中少量的清亮血清。

2 試劑的保存及配置

(1)禽流感血凝抑制試驗(yàn)所用的抗原應(yīng)保存在-20℃,試驗(yàn)前應(yīng)提前將其恢復(fù)至室溫,反復(fù)凍融會降低抗原的滴度,應(yīng)避免反復(fù)凍融。

(2)pH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備:應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配,不應(yīng)保存太久;

每次使用前應(yīng)測PH值,以免時間過長而導(dǎo)致PH值發(fā)生改變;不建議使用生理鹽水;全部試驗(yàn)均采用同一種稀釋液。

(3)1%紅細(xì)胞的制備

為避免有些雞只的紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象,因此配制1%紅細(xì)胞懸液時應(yīng)最好選擇2~3只SPF雞或未進(jìn)行過任何免疫過的成年公雞血液。采血時將血液與等體積阿氏液混合,以防血液凝固。

經(jīng)2000~3000r/min,5~10min,棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜,再加入PBS液,上下緩慢顛倒(切忌用力過大使紅細(xì)胞破裂),使其充分混勻,再離心棄去上清液,反復(fù)幾次直至上清液清亮透明為止。

制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅,說明有溶血,不可再使用。不用的紅細(xì)胞懸液應(yīng)4℃冷藏,且不超過2d。

3 四單位抗原的配制

(1)四單位抗原應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。先對抗原做血凝試驗(yàn),以抗原和紅細(xì)胞完全凝集的孔作為抗原效價(jià),再根據(jù)抗原效價(jià)配制四單位抗原。

(2)每次做試驗(yàn)前,必須重新檢測禽流感抗原的血凝效價(jià),以免效價(jià)發(fā)生改變而導(dǎo)致抗原稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確,從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

(3)為保證配制的四單位抗原準(zhǔn)確,還要進(jìn)行回標(biāo)試驗(yàn)。具體方法:做二排抗原回標(biāo),在第一、二排的第1~4孔各加25微升PBS,取四單位抗原25微升加在第1孔,混勻,從第2孔倍比稀釋至第4孔,棄去25微升,各孔再加25μlPBS,然后各孔加25微升1%紅細(xì)胞,震蕩10s,靜置30min觀察結(jié)果。第二孔完全凝集表明四單位抗原配制準(zhǔn)確,如果抗原回滴試驗(yàn)不成立,應(yīng)相應(yīng)調(diào)整抗原濃度直至回標(biāo)試驗(yàn)成立。因?yàn)槿绻乖瓭舛冗^高,則所測定的抗體效價(jià)水平偏低,如果抗原濃度過低,則所測定的效價(jià)偏高,所以不調(diào)整抗原濃度至回標(biāo)試驗(yàn)成立的話會對結(jié)果有很大影響。

4 移液槍的使用

(1)使用時應(yīng)采用一檔吸液二檔排液的方法。

(2)吸取液體時,槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時應(yīng)加在板孔底部。倍比稀釋血清時,應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸6次,以便混合均勻,還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣,以免交叉污染,影響試驗(yàn)結(jié)果。

(3)加樣、倍比稀釋時應(yīng)高度集中注意力,以免漏加、重復(fù)加樣等。

5 結(jié)果的判定

每次試驗(yàn)必須設(shè)陽性及陰性(空白)對照血清,判別試驗(yàn)是否成立。判讀結(jié)果時,將酶標(biāo)板傾斜45°,以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動性好,呈淚珠樣流淌,邊緣無凝集顆粒為凝集完全抑制。

6 試驗(yàn)器具的清洗

每次試驗(yàn)完畢后,應(yīng)將酶標(biāo)板中液體甩凈,然后用自來水反復(fù)沖凈每個孔,再放入3%NaOH中4h,清水反復(fù)沖凈,再放入3%HCl中4h,清水反復(fù)沖凈,再用蒸餾水反復(fù)沖洗幾次,甩干水份,入干燥箱中干燥備用。實(shí)驗(yàn)用燒杯、量筒等也應(yīng)充分洗凈、高壓消毒、干燥,以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗(yàn)結(jié)果。

7 小結(jié)

影響禽流感血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的因素很多,需要各個環(huán)節(jié)嚴(yán)格操作,平時多加練習(xí),才能為實(shí)際的免疫工作提供準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

[1] 王延樹,張芳.血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要領(lǐng)[J].中國動物保健,2009,11(8):75-76.

[2] 舒躍龍,王敏,張燁,等.一種敏感的H5禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)方法[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,(2):9-10.

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