IGF-Ⅰ腹腔注射對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用

張有辰，許春花，池永學，金正勇

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉 133000)

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IGF-Ⅰ腹腔注射對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用

張有辰，許春花，池永學，金正勇

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉 133000)

目的觀察胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)腹腔注射對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用，并探討其機制。方法將30只新生Wistar大鼠隨機分為空氣組、高氧組、干預組，每組10只新生。高氧組、干預組制備高氧肺損傷模型，空氣組和高氧組、干預組從造模第1天起分別腹腔注射生理鹽水和重組IGF-Ⅰ，6 μg/(kg·d)，連續7 d，計算各組肺組織干濕重比(W/D)，計數支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數，對BALF中的細胞進行Diff-Quik染色，HE染色觀察肺組織病理，核染色結合TUNEL觀察肺細胞凋亡情況，Western blotting法檢測肺組織GRP78、CHOP蛋白。結果干預組、高氧組、空氣組大鼠肺組織W/D分別為5.94±0.18、6.38±0.13、5.58±0.21，BALF中白細胞總數分別為(72.37±3.18)×107/L、(166.02±5.36)×107/L、(27.67±1.01)×107/L，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P均<0.05。肺組織病理切片觀察可見干預組較高氧組肺水腫減輕。干預組、高氧組、空氣組新生大鼠肺細胞凋亡指數分別為10.0%±0.7%、16.3%±0.7%、4.2%±0.9%，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P均<0.05。干預組、高氧組、空氣組大鼠肺組織GRP78分別為0.36±0.07、0.43±0.09、0.24±0.04，CHOP分別為1.46±0.11、1.63±0.13、0.62±0.08，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P均<0.05。結論IGF-Ⅰ腹腔注射對新生大鼠高氧肺損傷有防治作用，其機制可能為下調CHOP、GRP78蛋白表達。

胰島素樣生長因子Ⅰ；高氧肺損傷；GRP78蛋白；CHOP蛋白

隨著我國近幾年新生兒搶救水平的不斷提高，新生兒的生存率明顯增加，常用于早產兒搶救治療中的氧療所導致的肺損傷發生率也呈現逐年上升趨勢，并成為降低新生兒生存率的重要因素之一。研究[1]發現，高氧誘導后新生大鼠肺細胞凋亡增加，且隨著高氧時間延長其細胞凋亡程度逐漸加重，認為肺細胞凋亡是導致支氣管肺發育不良(BPD)的重要原因。胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是胰島素生長因子家族成員之一，是由70個氨基酸組成的單鏈堿性蛋白，是在胎兒生長發育中起重要作用的生長因子[2]。研究[3,4]報道，IGF-Ⅰ通過促進細胞DNA合成和代謝，促使細胞進入G1期，從而有利于細胞增殖，同時通過PI3K/Akt和MAPK信號途徑的交叉作用抑制各種細胞凋亡。2013年9月～2016年1月，本研究觀察了IGF-Ⅰ腹腔注射對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑 新生Wistar大鼠30只，體質量7～10 g，購自延邊大學動物科，動物許可證號：SYXK(吉)2007-0011)。重組IGF-Ⅰ(Sigma公司)，CHOP抗體(Santa cruz公司)，GRP78抗體(Santa cruz公司)，SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(Solarbio公司)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)，Diff-Quik染色試劑盒(深圳華康生物醫學工程有限公司)。

1.2高氧肺損傷模型的制備將30只新生大鼠隨機分為空氣組、高氧組、干預組，每組10只。將高氧組與干預組新生大鼠置于玻璃箱內，持續吸入氧氣，氧濃度為85%以上，空氣組在同一室內吸常壓空氣，玻璃箱與室內溫度為25～26 ℃，濕度為60%～70%?？諝饨M和高氧組、干預組從造模第1天起分別腹腔注射生理鹽水和重組IGF-Ⅰ，6 μg/(kg·d)，連續7 d。

1.3觀察方法制備模型第7天，各組進行下列操作。 ①肺組織干濕重比(W/D)計算：新生大鼠10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉后，剪開胸腔，充分暴露肺組織，分離氣管和肺組織，結扎右支氣管，取下結扎的右肺，擦干肺組織表面，稱重后記錄肺濕重，置于80 ℃烤箱內，每天稱重1次，直至連續2 d重量無明顯變化，后置于37 ℃烤箱內，記錄肺干重，計算肺W/D。 ②支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數：新生大鼠麻醉后，沿正中線切開頸胸部，并剝離氣管周圍的肌組織，充分暴露氣管頸段并切開，將細靜脈管插入氣管中，注入1 mL的生理鹽水溶液，然后反復回抽3次，取得BALF。將BALF在1 300 r/min、4 ℃下離心10 min，去除上層液，余下細胞用適量的生理鹽水溶液反復吹打懸浮，用細胞計數板，顯微鏡計算白細胞總數。 ③BALF中細胞Diff-Quik染色：載玻片上涂抹BALF的細胞，嚴格按Diff-Quik染色試劑盒說明書操作，在100倍光學纖維鏡下，每組隨機抽取細胞涂片，取10個視野記錄每平方毫米內的細胞數(N/mm2)，并在100倍的倍率下攝影。④肺組織病理：新生鼠處死后，肺組織用4%多聚甲醛灌注固定20 min，再浸入4%多聚甲醛外固定，常規脫水，透明，浸蠟包埋，超薄切片，作HE染色,每組大鼠各做一張切片。觀察各組肺泡發育和損傷程度。⑤肺細胞凋亡情況：將肺組織包埋切片，做核染色結合TUNEL觀察各組肺細胞凋亡情況，熒光顯微鏡下觀察各組凋亡細胞。每張切片記錄500個肺泡細胞，計算每100個細胞內陽性細胞數，以百分數表示肺細胞凋亡指數。⑥肺組織GRP78、CHOP蛋白檢測：采用Western blotting法。組織標本離體后浸泡于液氮中速凍，后置于-70 ℃冰箱內保存。常規勻漿、離心制備組織蛋白抽提液,提取上樣8%聚丙烯酰胺凝膠進行還原性SDS-PAGE電泳,半干式轉膜(PVDF膜),300 mA恒流40 min。封閉液封閉后PVDF膜過夜,TBS-T緩沖液中充分振蕩清洗,分別滴加一、二抗,一、二抗終濃度稀釋比例為1∶2 000,ECM顯色。X光片曝光后顯影、定影、晾干。用凝膠成像系統定量分析結果，用Image J軟件測定灰度值，將與β-actin條帶灰度值的比值作為其蛋白的相對表達量。

2　結果

干預組、高氧組、空氣組大鼠肺組織W/D分別為5.94±0.18、6.38±0.13、5.58±0.21，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P均<0.05。干預組、高氧組、空氣組BALF中白細胞總數分別為(72.37±3.18)×107/L、(166.02±5.36)×107/L、(27.67±1.01)×107/L，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P<0.05或<0.01。肺組織病理切片觀察可見，空氣組肺泡結構完整，間質無水腫，較少炎癥細胞浸潤；高氧組肺內小血管擴張充血，血管壁及小支氣管壁水腫，偶見少量纖維組織增生，肺泡腔及小氣道周圍可見少量炎癥細胞，以中性粒細胞及巨噬細胞為主；干預組與高氧組相比，炎癥細胞明顯減少，肺水腫減輕?？諝饨M肺組織中可見少量細胞凋亡陽性細胞，凋亡細胞以肺泡上皮細胞、小氣道上皮細胞及血管內皮細胞為主。空氣組肺細胞DAPI染色，熒光顯微鏡下核呈均勻的藍色；高氧組凋亡的肺細胞核呈凝聚的亮白色，肺細胞核內可見亮白色的凋亡小體，TUNEL熒光染色中正常的細胞核不著色，凋亡的細胞核呈綠色圓形小體。干預組、高氧組、空氣組新生大鼠肺細胞凋亡指數分別為10.0%±0.7%、16.3%±0.7%、4.2%±0.9%，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P均<0.05。干預組、高氧組、空氣組大鼠肺組織GRP78分別為0.36±0.07、0.43±0.09、0.24±0.04，CHOP分別為1.46±0.11、1.63±0.13、0.62±0.08，高氧組與空氣組相比，干預組與高氧組相比，P均<0.05。

3　討論

極低出生體重兒出生后肺發育尚未成熟，需長期暴露于高氧環境中。長時間吸入高濃度氧可引起BPD。有研究[5]報道，長期暴露在高氧中新生大鼠肺損傷的發生與人類新生兒BPD類似，BPD的病理過程已被公認為早期肺水腫及晚期肺間質纖維化、肺泡發育障礙。內質網應激(ERS)與很多疾病的發生、發展密切相關，ERS與高氧肺損傷的關系日益受到關注。研究[6～8]表明，內質網過氧化可影響蛋白質的正確折疊，導致未折疊蛋白反應(UPR)，UPR經其膜上的PERK、IRE1及ATF6等3個跨膜蛋白轉導應激信號而發生反應。CHOP是一個ERS應激轉錄因子,其表達引起凋亡。ERS的標志性分子GRP78在ERS中起關鍵的調節作用，是細胞的一種重要的防御機制。IGF-Ⅰ作為體內重要的生長因子在組織細胞的增殖、分化、凋亡及機體的生長發育中起重要的調節作用。孕15周時胎兒體內可以檢測到IGF-Ⅰ，胰島素生長因子對胎兒的作用機理尚不十分清楚，但其在胎兒生長發育方面的作用已得到人們普遍認同。在肺發育的各個階段中IGF-Ⅰ mRNA均有表達，表明IGF-Ⅰ是在肺生長發育中起重要作用的生長因子[9]。研究[10]表明，高氧肺損傷后第3、7天，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅰ受體、IGF-Ⅱ表達均增高，且對高氧損傷后的修復有重要意義。生后7 d新生大鼠肺的發育與新生兒出生時相似[11]，本實驗采用大鼠高氧肺損傷模型[12]，此模型研究已得到廣泛利用與肯定。本實驗結果顯示，高濃度氧可引起大鼠肺組織W/D明顯增加，誘發肺水腫。高氧可引起BALF中白細胞增高，引起肺組織損傷并加重肺細胞凋亡。IGF-Ⅰ能減輕高氧誘導引起的肺水腫及炎癥，并對高氧肺細胞凋亡有明顯抑制作用，這與文獻[13]報道一致。進一步研究發現，高氧可導致大鼠肺組織GRP78、CHOP蛋白表達升高，IGF-Ⅰ能下調其表達。

綜上所述，IGF-Ⅰ腹腔注射對新生大鼠高氧肺損傷有防治作用，其機制可能為下調CHOP、GRP78蛋白表達。

[1] Jobe AH. The new bronchopulmonary dysplasia[J]. Curr Opin Pediatr, 2011,23(2):167-172.

[2] 錢禎,周倩,王凱.胰島素樣生長因子系統在胎兒生長發育中的作用[J].生殖與避孕,2014,34(3):227-231.

[3] 史琳琳,趙鋒,高學軍,等.催乳復合物、胰島素樣生長因子-Ⅰ對奶牛乳腺上皮細胞中AKT-1和mTOR表達的作用[J].中國畜牧獸醫,2013,40(3):23-27.

[4] 郭玲,王敏,郝亮.胰島素樣生長因子1對小鼠成骨細胞增殖和堿性磷酸酶活性的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(33):6095-6098.

[5] 金梅花,金正勇.乳糖酸阿奇霉素對新生大鼠高氧肺損傷的影響[J].延邊大學醫學學報,2015,38(3):187-189.

[6] 王洪巖,劉曉珺,杜雅菊,等.內質網應激與肝臟疾病研究進展[J].世界華人消化雜志,2012,17(6):451-459.

[7] 劉友平,嚴冬梅,陳川寧,等.PI3K/Akt調控內質網應激對GRP78的誘導[J].中國病理生理雜志,2011,27(4):749-754.

[8] 李劍,羅子國.CHOP在內質網應激介導凋亡中的作用[J].檢驗醫學與臨床,2011,8(2):208-211.

[9] 曾永芬,黃義德.胰島素樣生長因子1及其在組織和器官生長發育中的作用[J].生命科學研究,2015,19(2):165-168，184.

[10] Kim TH, Chow YH, Gill SE, et al. Effect of insulin-like growth factor blockade on hyperoxia-induced lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012,47(3):372-378.

[11] 許春花,金正勇.雌激素對新生大鼠高氧肺損傷的影響[J].延邊大學醫學學報, 2011,34(2):89-92.

[12] 蘇立明,池永學,金正勇,等.促紅細胞生成素對哮喘模型小鼠肺部炎癥改變及細胞因子的影響[J].中國婦幼保健,2015,30(12):1927-1930.

[13] 金貞愛,趙以坤,金正勇,等.胰島素樣生長因子-1對高氧誘導的A549細胞凋亡的影響[J].中國當代兒科雜志,2013,15(6):490-493.

國家自然科學基金資助項目(NO81160083)。

金正勇(E-mail： jinzhengyong2003@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.011

R364

A

1002-266X(2016)23-0036-03

2016-01-04)