健康直系親體靶向DC-CIK細(xì)胞的制備及在惡性腫瘤免疫治療中的應(yīng)用*

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院(西安710054)　劉征麗　張　濰　張學(xué)成　趙　花　閻　琨　張　菊

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健康直系親體靶向DC-CIK細(xì)胞的制備及在惡性腫瘤免疫治療中的應(yīng)用*

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院(西安710054)劉征麗張濰△張學(xué)成趙花閻琨張菊#

摘要目的：探討健康直系親體負(fù)載腫瘤干細(xì)胞抗原的靶向DC-CIK細(xì)胞的制備方法及對惡性腫瘤患者的治療價(jià)值。方法：43例惡性腫瘤患者，用智能單采機(jī)采集健康直系親體的外周血單個(gè)核細(xì)胞，其中貼壁細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞(DC)，懸浮細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生CIK，DC負(fù)載不同腫瘤干細(xì)胞抗原制備靶向DC 細(xì)胞，將靶向DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備靶向DC-CIK，檢測靶向DC-CIK細(xì)胞表面分子的表達(dá)及細(xì)胞增殖情況，并將靶向DC-CIK分6次回輸給43例患者，治療3個(gè)療程后，結(jié)合影像學(xué)等檢查綜合評價(jià)臨床治療的療效，同時(shí)觀察不良反應(yīng)。結(jié)果：靶向DC 細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，可明顯刺激CIK細(xì)胞的增殖，同時(shí)CD3+CD8+細(xì)胞，CD56+及CD3+CD56+細(xì)胞的含量明顯增加，43例惡性腫瘤患者接受健康直系親體靶向DC-CIK細(xì)胞輸注，PR17例，SD 25例，PD 1例，臨床療效明顯，無不良反應(yīng)。結(jié)論：健康直系親體靶向DC-CIK細(xì)胞應(yīng)用于惡性腫瘤患者效果確切、無明顯不良反應(yīng)。

主題詞腫瘤 細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞分子靶向治療免疫療法

免疫治療正在成為晚期惡性腫瘤的有效手段，但由于中晚期惡性腫瘤患者，曾接受過手術(shù)、化療或放療，對其自身情況、血液細(xì)胞均有不同程度影響，其自體的單核細(xì)胞，無論從數(shù)量和質(zhì)量上均較健康人明顯減低[1-2]。惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程中腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮著決定性的作用[3-4]。我院2014年4月至2015年8月采用患者的直系健康親屬提供單核細(xì)胞，針對惡性腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行特異免疫治療，培養(yǎng)出惡性腫瘤靶向DC-CIK細(xì)胞應(yīng)用于中、晚期惡性腫瘤患者取得了良好的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

對象與方法

1對象經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)檢查確診為中、晚期腫瘤患者，宮頸癌33例，肺癌10例，女36例，男7例，年齡 25～81歲。均在行細(xì)胞治療之前進(jìn)行過手術(shù)、放化療，手術(shù)、放化療與細(xì)胞治療間隔在 4 周以上。所有患者Karnofsky評分≥60分，治療前肝、腎功能及血常規(guī)正常，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月，符合細(xì)胞免疫治療要求，自愿并簽署知情同意書，均采用健康直系親體DC-CIK 細(xì)胞免疫治療方法。

2主要試劑與儀器重組人細(xì)胞因子( rhGM-CSF，rhIL-4，rhTNF-α，rhIFN-γ，rhlL-2) 均購自Peprotech公司; 宮頸癌、肺癌干細(xì)胞抗原購自西安瑞澤生物技術(shù)公司；小鼠抗人CD3 mAb購自Bioscience公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗人CD3抗體、FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD8抗體、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD56抗體購自Biolegend公司，流式細(xì)胞儀購自BD PharMingen公司;生物超凈臺及CO2培養(yǎng)箱均為上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

3健康直系親體采血前檢查健康直系親體在進(jìn)行細(xì)胞采集之前，檢驗(yàn)證明各型肝炎病毒、HIV、梅毒螺旋體等均為陰性，同時(shí)排除自身免疫性疾病(如慢性淋巴性甲狀腺炎、潰瘍型結(jié)腸炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和糖尿病等)，有證明健康供血者是患者的直系親屬資料。

4外周血單個(gè)核細(xì)胞采集在無菌條件下，由專職人員使用全自動(dòng)智能血細(xì)胞分離機(jī)，采集供血者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到 1×109以上，單采管及所有耗材均為一次性。

5細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)及鑒定①樹突狀細(xì)胞(DC)的培養(yǎng)誘導(dǎo)：單采獲得的PBMC，加入到CIK細(xì)胞培養(yǎng)液中；在37℃，50 ml/L CO2孵箱中貼壁2 h，其中貼壁細(xì)胞為DC前體細(xì)胞，懸浮細(xì)胞為CIK前體細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞以備CIK細(xì)胞培養(yǎng)。在貼壁細(xì)胞中加入濃度為100 ng/ml的rhGM-CSF和rhIL-4，隔日等量補(bǔ)充細(xì)胞因子。培養(yǎng)第5天的DC中加入終濃度為1μg/ml的腫瘤干細(xì)胞抗原致敏DC，第7天收集成熟的靶向DC。②CIK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)及表型鑒定：懸浮細(xì)胞加入到CIK細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入濃度為1000 U/ml的IFN-γ，于50 ml/L CO237℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加入終濃度均為1000 U/ml的IL-2及1μg/ml小鼠抗人CD3 mAb，繼續(xù)50 ml/L CO237℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日半量加液，并補(bǔ)充IL-2；在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第7天與靶向DC混合共培養(yǎng)，第15天時(shí)收集靶向DC-CIK細(xì)胞，取部分細(xì)胞以流式細(xì)胞儀測定CD3+CD8+，CD56+和CD3+CD56+細(xì)胞的比例，應(yīng)用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)CIK細(xì)胞的增殖情況。

6免疫治療方案收集擴(kuò)增第15天的靶向DC-CIK細(xì)胞，檢測活細(xì)胞比例>95%，1500 r/min生理鹽水洗滌2次，檢定無細(xì)菌及真菌污染，內(nèi)毒素檢測合格≤10 EU/ml，將細(xì)胞懸浮于250 ml生理鹽水中靜脈滴注，1次/d，每次回輸?shù)募?xì)胞數(shù)量不低于5×109，避光條件下將細(xì)胞回輸完畢。連續(xù)回輸6 d為1個(gè)療程，每隔30 d治療1個(gè)療程，共3個(gè)療程。

7觀測指標(biāo)及療效評估觀測指標(biāo)包括瘤體變化、生存期、生活質(zhì)量、不良反應(yīng)等。參照實(shí)體瘤療效RECIST判定標(biāo)準(zhǔn): 以患者治療前及治療后3個(gè)月CT及B超進(jìn)行對照比較，以完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD) 進(jìn)行療效評定，有效=CR+PR。CR：所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標(biāo)志物正常，至少維持4周;PR：靶病灶最大徑之和減少30%，至少維持4周；SD：靶病灶最大徑之和縮小未達(dá)PR，或增大未達(dá)疾病進(jìn)展；PD: 靶病灶最大徑之和至少增加 20%，或出現(xiàn)新病灶，如僅一個(gè)靶病灶的最長徑增大20%，而記錄到的所有靶病灶的最長徑之和增大未達(dá)20%，則不評為PD。每個(gè)患者在治療后24 h內(nèi)觀察過敏反應(yīng)和其他毒性反應(yīng)，治療后每2周行血常規(guī)、肝腎功能，心電圖檢查。以患者主訴為依據(jù)記錄睡眠、食欲、疼痛及體力狀況。

結(jié)果

1細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察及表型鑒定DC細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸呈現(xiàn)出樹枝狀等多種形態(tài)。加入腫瘤干細(xì)胞抗原致敏的DC細(xì)胞體積顯著增加，DC細(xì)胞內(nèi)粗顆粒顯著增加，成熟速度與比例加大，逐漸成熟懸浮，培養(yǎng)第7天時(shí)不需細(xì)胞刮鏟即可收集。CIK細(xì)胞自培養(yǎng)第6天開始，增殖增快，數(shù)量增多，形成集落，而與腫瘤干細(xì)胞抗原致敏的DC細(xì)胞共培養(yǎng)后，增殖明顯快，體積增大，細(xì)胞內(nèi)顆粒變粗，第14天時(shí)，靶向 DC-CIK細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)7～10×1010。靶向DC-CIK細(xì)胞CD3+CD8+和CD3+CD56+，CD56+的表達(dá)均在30%以上。

2療效43例惡性腫瘤患者先后接受了3個(gè)療程健康直系親體靶向DC-CIK細(xì)胞治療，無CR病例，PR17例，SD 25例，PD 1例，臨床療效明顯。一般狀況，如睡眠、飲食、疼痛及體力狀況等均有明顯改善者42例，占97.67%；輸注后夜間過度興奮、不能安靜入睡者1例，占2.33%，其原因有待探討。

3不良反應(yīng)43例惡性腫瘤患者，發(fā)熱7例，出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、疲乏、無力、關(guān)節(jié)肌肉酸痛等不適占16.28%，但均在24 h內(nèi)自行消退。未見其它不良反應(yīng)，所有患者隨訪時(shí)間均超過3個(gè)月。

討論

我國惡性腫瘤患病率和病死率逐年增加，且患者日益年輕化。近年腫瘤免疫治療取得顯著進(jìn)步，DC/CIK細(xì)胞免疫療法已成為腫瘤治療的重要手段[5-6]。

樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，CIK是外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子培養(yǎng)激活后獲得的非MHC限制性、對腫瘤細(xì)胞具殺傷毒性的NK樣T細(xì)胞，兼具T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn)，是一群以CD3+CD56+T為主效應(yīng)細(xì)胞包括α/βT細(xì)胞，γ/δT細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞，高效、廣譜殺傷、非MHC限制。DC-CIK細(xì)胞兩者聯(lián)合能有效清除腫瘤患者殘存的腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展，是目前臨床過繼免疫治療中最有效的效應(yīng)細(xì)胞[7-9]。

DC-CIK細(xì)胞主要來源于外周血單個(gè)核細(xì)胞，惡性腫瘤中、晚期患者自身免疫功能低下，且均接受過放、化療，其自身的單個(gè)核細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量會(huì)有一定程度的降低。我們采用患者的直系健康親屬提供的單個(gè)核細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量均較腫瘤患者優(yōu)良，其細(xì)胞活性強(qiáng)、數(shù)量多易于培養(yǎng)，易于增殖；本研究用腫瘤干細(xì)胞抗原刺激DC細(xì)胞，DC細(xì)胞捕獲加工的平時(shí)隱蔽的腫瘤抗原，形成肽-MHC分子復(fù)合物，遞呈給T細(xì)胞，從而啟動(dòng)抗原特異性CTL反應(yīng)；在腫瘤干細(xì)胞抗原激活物中還含DC協(xié)同共刺激分子(B7-1、B7-2等)提供T細(xì)胞活化所必須的第二信號，啟動(dòng)了特異和非特異免疫應(yīng)答，增加了CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)；增強(qiáng)了CIK腫瘤殺傷效力。因此，對于中、晚期惡性腫瘤患者，限于自身情況難以提供優(yōu)良的單個(gè)核細(xì)胞以用來培養(yǎng)DC-CIK細(xì)胞，應(yīng)用直系親屬的單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用腫瘤干細(xì)胞抗原刺激獲得靶向DC-CIK細(xì)胞對于維持腫瘤穩(wěn)定不進(jìn)展，緩解患者病痛與不適，提高其生活質(zhì)量，延緩壽命具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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(收稿：2015-09-10)

Therapeutic efficacy of dendritic cells pulsed by antigen from cancer stem cells in combination with CIK cells of immediate children health on advanced cancer

The Armed Police Corps Hospital of Shaanxi Province(Xi’an 710054)

Liu ZhengliZhang WeiZhang Xuechenget al

ABSTRACTObjective: To investigate the clinical efficacy of dendritic cells( DCs) sensitization by antigen from cancer stem cells in combination with cytokine-induced killer (CIK) cells on patients with advanced cancer and detect their immune functions and adverse effects.Methods: The study analyzed retrospectively 43 patients with advanced cancer admitted in our department．Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from Immediate children health of the above patients．Adherent cells were cultured to produce DCs．The DCs were pulsed with antigens from cancer stem cells to produce target DCs.T lymphocytes were cultured to prepare CIK．The target DCs was co-cultured with CIK to produce target DC-CIK，and then the phenotypes of target DC-CIK were evaluated.The target DC-CIK cell proliferation was determine，too.The 43 patients received the immunotherapy of target DC-CIK for 3 circles.After treatment，the changes of T cell subtypes and cytokines released in the peripheral blood were evaluated．The therapeutic outcomes were evaluated．The adverse effects were also observed.Results: CIK cell proliferation was significantly enhanced after co-cultured with target DCs．Meanwhile，the percentages of CD3+CD8+ cells， CD56+ and CD3+CD56+cells went up significantly．Clinical responses of the target DC-CIK treatment group were good．No severe adverse effects were seen in the patients．Conclusion：DCs derived from PBMCs of Immediate children health of advanced cancer patients harboring antigens from cancer stem cells can differentiate into mature DCs，which facilitate the proliferation of CIK cells．The targrt DC-CIK therapy improves the immune status of patients with advanced cancer．

KEY WORDSNeoplasmsCytokine-induced killer cellsMolecular targeted therapyImmunotherapy

【中圖分類號】R730.51

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.017

*陜西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014JM4117)

△第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科

#第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系基因診斷技術(shù)研究所