Wnt/β-catenin信號通路相關分子在肝癌靶向治療中的研究進展

李圣杰，楊之斌

(昆明醫科大學第三附屬醫院，昆明650118)

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Wnt/β-catenin信號通路相關分子在肝癌靶向治療中的研究進展

李圣杰，楊之斌

(昆明醫科大學第三附屬醫院，昆明650118)

摘要：肝癌發病率及病死率均較高Wnt/β環連蛋白(β-catenin)信號通路中多個環節發生異常改變都可能與肝癌發生、發展密切相關，著力于該信號通路的靶向治療成為研究的熱點。目前，在肝癌中開展了以Wnt/β-catenin信號通路激活起始分子Wnt蛋白、胞膜Wnt受體和輔助受體、胞膜胞內信號傳遞銜接子、胞內復合體、核內轉錄復合體及信號通路抑制子為靶點的實驗研究，應用前景廣闊，但真正運用于臨床尚需時日。

關鍵詞：原發性肝癌；Wnt蛋白；β連環蛋白；信號通路；靶向治療

目前，肝癌的發病機制仍不十分清楚，研究發現細胞信號轉導對其發生、發展有著重要作用，其中有關Wnt/β連環蛋白(β-catenin)信號通路研究最多且相關機制解釋較為清楚。Wnt/β-catenin通路由Wnt蛋白與跨膜受體結合，將Wnt信號傳遞至胞質蛋白，經過一系列的復雜反應致使胞內β-catenin水平增高，隨后β-catenin發生核移位，與核內轉錄因子結合激活下游靶基因。其中，跨膜受體包括卷曲蛋白(Fzd)及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 (LRP5/6)，胞質蛋白包括散亂蛋白(Dvl)、結腸腺瘤樣息肉病蛋白(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、軸蛋白(Axin)、β-catenin及泛素蛋白(Ub)等，核內轉錄因子主要包括轉錄活化因子(CBP)及T細胞轉錄因子/淋巴樣增強因子(TCF/LEF)等，下游靶基因則有c-myc、細胞周期蛋白(cyclin) D1、survivin、gastrin、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)等。在多種高發性腫瘤中，Wnt/β-catenin信號通路都發揮了非常重要的作用，是腫瘤病理及靶向藥物研究的熱點。現將Wnt/β-catenin信號通路相關信號分子在肝癌靶向治療中的研究進展作一綜述。

1以信號通路激活起始分子Wnt蛋白為靶點

作為Wnt信號的起始分子，目前已知的Wnt蛋白有19種。Wnt蛋白在細胞生長分化、胚胎形成及腫瘤發生等過程中發揮著重要作用，抑制腫瘤Wnt蛋白與胞膜受體結合可作為有效的靶點[1]。Wei等[2]研究發現，抗Wnt-1抗體能夠有效地抑制β-catenin/TCF4轉錄活性，下調其靶基因c-myc、cyclin D1、survivin的表達，在兩種不同的肝癌細胞系中抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，還能有效抑制裸鼠移植瘤的生長。

2以胞膜Wnt受體、輔助受體為靶點

Wnt受體Fzd是一類跨膜蛋白，由胞外區、跨膜區、胞內區構成，胞外區為一段半胱氨酸富集結構域，跨膜區是與G蛋白偶聯受體類似的七螺旋跨膜結構，胞內段是羧基端區域。Wnt配體通過與Fzd胞外段結合改變膜受體構象將信號傳遞至胞內。Wnt輔助受體LRP5/6也由胞外區、跨膜區、胞內區結構，胞外區能協同Fzd將胞外信號傳遞至胞內，胞內區可招募骨架蛋白(如Axin)并使其降解，促進β-catenin的胞內聚集[3]。研究證明，治療性單克隆抗體能夠有效結合Wnt受體的胞外域，通過切斷受體、配體的結合來阻斷Wnt信號的傳遞，因此，Fzd以及LRP5/6蛋白都是這類治療方式的潛在靶點。Gurney等[4]發現一種OMP-18R5單克隆抗體能夠與Fzd1、Fzd2、Fzd5、Fzd7、Fzd8胞外段緊密結合，阻斷絕大多數起始于Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等多種Wnt蛋白的致癌效應信號，降低LRP6胞內段的磷酸化及β-catenin的胞內聚集，明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。目前，美國OncoMed公司正進行OMP-18R5的臨床一期試驗。另外一種特異性靶向結合Fzd8的單克隆抗體OMP-54F28[5]則能阻斷所有的Wnt配體與Fzd8結合，從而阻斷Wnt信號傳遞，其一期臨床試驗正由拜耳公司著手進行。此外，Wei等[6]發現，可溶性Fzd7能夠與胞外Wnt3a配體結合，競爭性抑制Wnt3a配體與胞膜Fzd7受體結合，抑制Wnt/β-catenin信號傳遞，降低肝癌細胞生存能力，正常肝細胞卻不受影響，并且還能增強阿霉素對肝癌細胞的抗增殖效應。

3以胞膜胞內信號傳遞銜接子Dvl為靶點

Dvl是將Wnt信號從胞膜傳遞到胞內的關鍵蛋白，其含有3個保守的功能結構域，即N端DIX結構域、核心PDZ結構域、C端DEP結構域。DIX結構域介導Dvl在受到Wnt信號刺激后發生聚集[7]；DEP結構域在調節上皮細胞平面極性功能時保障與細胞膜上脂類緊密結合[8]；PDZ結構域能與Fzd胞內段直接結合，抑制GSK-3β活性，β-catenin的磷酸化過程受抑制，非磷酸化的β-catenin在胞內聚集，從而將Wnt信號從胞膜傳遞到胞內[9]。鑒于Dvl的PDZ結構域與Fzd胞內段在Wnt/β-catenin信號傳遞中起到重要的銜接作用，因此PDZ結構能夠作為理想的藥物靶標。Dapper蛋白可以與Dvl的PDZ結構域結合，致使Dvl溶解，從而阻斷Dvl與Fzd結合[10]。類似于Dapper蛋白，一些小分子化合物例如NSC668036、J01-017a、3289-8625能與Dvl的PDZ結構域結合，抑制Wnt/β-catenin信號傳遞。

4以胞內復合體為靶點

Wnt信號通路中關鍵樞紐分子β-catenin由胞質向胞核的轉位是該信號通路被激活后行使功能的標志。Tien等[11]研究表明，β-catenin在肝癌細胞中表達陽性率高，細胞膜上表達高于細胞質內表達，在中、低分化肝癌的胞核中存在β-catenin的表達。胞質內的β-catenin與GSK-3β、APC、Axin、CK1構成的破壞復合體能介導β-catenin在胞內被降解而處于較低的水平，當該復合體受到破壞時β-catenin在胞內大量集聚，進而入核激活靶基因，因此胞內β-catenin的水平在Wnt信號通路起著決定性作用[12]。降低胞質內β-catenin水平及抑制胞質內β-catenin向核內轉移能有效抑制腫瘤發生、發展，是抗癌治療研究的重要分子靶位。Axin與APC在該復合體中扮演了骨架蛋白的作用，其他4種蛋白與之結合形成復合體，Axin、GSK-3β、CK1能調控β-catenin磷酸化促進其泛素化降解過程。Li等[13]研究發現，野生型Axin基因過表達能抑制肝癌細胞系的生長，促進其凋亡，下調cyclin水平，負向調控β-catenin轉錄活性。有研究證實，小分子FH535能夠直接降低β-catenin水平從而抑制肝癌HepG2細胞增殖[14]。撲蟯靈(Pyrvinium)被認為是CK1激活劑，能促進β-catenin的泛素化降解過程[15]；然而，也有研究稱Pyrvinium對CK1并無直接激活作用，而是通過下調Akt/PKB及激活GSK-3β來調控β-catenin的泛素化降解[16]。Wang等[17]用小分子干擾RNA沉默β-catenin的表達后能促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成。最近Gai等[18]發現，蟾毒靈(bufalin)能抑制GSK-3β上第9位絲氨酸殘基的磷酸化，從而降低β-catenin及其下游因子cyclin D1、MMP-7以及環氧合酶2在胞質內的表達水平，明顯降低肝癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力。

5以核內轉錄復合體為靶點

在細胞核中，β-catenin能與不同的DNA結合蛋白進行結合，進而重組染色質以調控轉錄程序。其中與β-catenin發生結合最重要的轉錄因子是TCF/LEF家族，包括TCF1、LEF1、TCF3、TCF4等。正常情況下核內缺乏β-catenin，阻遏蛋白如交互轉導樣增強子蛋白(TLE)和C端結合蛋白(CTBP)可與TCF/LEF相互作用，介導組蛋白去乙酰化和染色體固縮來抑制下游靶基因表達。下游靶基因如cyclin D1、survivin、PCNA、c-myc等一旦被激活，能發揮出不同級聯的放大效應：cyclin D1和PNCA一起調控著細胞從G1期進入S期；c-myc過表達則能維持腫瘤不斷生長并抵抗凋亡；survivin則主要介導腫瘤抗凋亡。由于β-catenin本身并不直接參與轉錄調控，而是通過與轉錄因子相互作用實現對下游相關基因表達的調控，因此抑制β-catenin與以TCF/LEF家族為代表的轉錄因子結合，阻礙調控轉錄復合體的形成，能阻斷信號通路往下游繼續發展，下游靶基因的表達受阻，從而抑制腫瘤進程。Wei等[19]研究證明，PKF118-310，PKF115-584，CGP049090能抑制β-catenin/TCF4與靶基因DAN序列結合，在體內外誘導肝癌細胞凋亡，將腫瘤細胞阻滯在G1/S期，并能明顯抑制小鼠移植瘤模型腫瘤生長。

6以信號通路抑制子為靶點

Wnt抑制蛋白1(WIF1)、分泌型卷曲蛋白相關蛋白(sFRP)能與Wnt配體結合，阻礙Wnt配體與膜Fzd受體結合，Dickkopf1(Dkk1)則能與能與LRP5/6結合抑制Wnt信號向下游傳遞。Hu等[20]用攜帶WIF1、sFRP基因的重組腺病毒轉染肝癌細胞，轉染后的細胞能穩定表達WIF1及 sFRP，并下調了E2F1、cyclin D1、c-myc等基因的表達，促進肝癌細胞凋亡，抑制細胞增殖，延長實驗動物生存期，說明WIF1、sFRP能夠抑制Wnt信號通路抑制肝癌進展。而Dkk1的腫瘤生物學特性至今存在爭議，一些研究提示Dkk1有抑制或促進腫瘤發生、發展的兩面性特征：一方面Dkk1被認為是腫瘤發生、發展的抑制子，例如González-Sancho等[21]研究發現Dkk1在結腸癌中低表達，提示Dkk1或許起到了腫瘤抑制子的作用；上調Dkk1的水平后，腸癌細胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力明顯降低。另一方面Dkk1在非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、膀胱癌中呈現高表達水平；而消減了Dkk1表達后，肝內膽管細胞癌細胞轉移、侵襲能力明顯減弱。Chen等[22]發現，Dkk1在肝癌細胞中高表達，上調Dkk1水平對肝癌細胞增殖、克隆形成能力并無影響，但可以上調β-catenin及MMP-7促進其轉移、侵襲能力。因此，對于Dkk1所扮演的角色我們仍需進一步研究探索。

探索肝癌新療法一直是肝癌研究領域的熱點，然而肝癌靶向藥物治療現狀仍不容樂觀。目前，僅有索拉菲尼一種靶向藥物受到FDA批準用于肝癌的治療，但由于其價格昂貴、不良反應多及患者耐藥性的產生，使其應用非常局限。Wnt/β-catenin信號通路在肝癌發生、發展中起重要作用，基于該信號通路在肝癌靶向治療的研究有很多，前景雖廣闊，但要真正運用于臨床仍有很長的路要走。只有對肝癌的發生、發展更加深入的認識，盡可能詳盡地闡述Wnt/β-catenin信號通路與其他信號通路之間的關系，宏觀調控，精準導向，也許不久的將來會給肝癌患者帶來福音。

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(收稿日期：2016-01-07)

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0099-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.045

通信作者：楊之斌(E-mail: yzblbab@vip.sina.com)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81560472)；云南省衛生廳內設機構基金資助項目(2014NS017，2014NS018)；云南省衛生廳昆醫聯合專項(2013FB166)。