金烏骨通膠囊中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定

萬紅才　段　萍　徐作剛　曾　琦

貴州省黔南州食品藥品檢驗所，貴州　都勻　558000

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金烏骨通膠囊中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定

萬紅才段萍徐作剛曾琦

貴州省黔南州食品藥品檢驗所，貴州都勻558000

【摘要】目的：建立測定金烏骨通膠囊中原兒茶酸和原兒茶醛含量的方法。方法：采用高效液相色譜法；色譜條件：安捷倫 C18柱(250mm× 4.6mm，5μm)，甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液為流動相(梯度洗脫)，流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：256nm。結果：原兒茶酸在0.0793～0.4758μg范圍內、原兒茶醛在0.00526～0.3153μg范圍內呈良好的線性關系；原兒茶酸平均回收率為97.01%，RSD 為1.41%(n=6)；原兒茶醛平均回收率為98.19%，RSD為1.82%(n=6)。結論：原兒茶酸峰與原兒茶醛峰及其他雜質峰能夠有效分離，其方法簡便，準確度、靈敏度高，重現性和穩定性好，能夠滿足本品有效成分質量控制的要求。

【關鍵詞】金烏骨通膠囊；高效液相色譜法；原兒茶酸，原兒茶醛；含量測定

金烏骨通膠囊由金毛狗脊、烏梢蛇、葛根、淫羊藿、姜黃、補骨脂、木瓜、土牛膝、土黨參、威靈仙等十味藥組成，具有滋補肝腎、祛風除濕、活血通絡的功效，臨床用于肝腎不足、風寒濕痹、骨質疏松、骨質增生引起的腰腿酸痛、肢體麻木等癥狀[1]。其中，金毛狗脊、木瓜的活性成分主要是原兒茶酸和原兒茶醛[2-3]。現代藥理實驗表明，原兒茶酸和原兒茶醛具有增加冠脈流量、抗炎等活性，體外具有抑血小板聚集、抗菌等生理活性[4-5]。有文獻采用薄層色譜法鑒別金烏骨通膠囊中的原兒茶酸和原兒茶醛[6]；研究采取高效液相色譜法測定其原兒茶酸和原兒茶醛含量，有助于更好的控制該藥品質量。

1儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1260 高效液相色譜儀；梅特勒AG135電子天平；島津UV-2401紫外分光光度計。

1 .2材料原兒茶酸(批號：810-200205)、原兒茶醛(批號：110810-200205)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；金烏骨通膠囊由貴州盛世龍方制藥有限公司提供；甲醇、乙腈均為色譜純；水為娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱(250mm×4. 6mm，5μm)；流動相：甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液，按表1梯度洗脫；流速：1.0ml/min，柱溫：35℃；檢測波長：256nm。

表1　甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液梯度洗脫表

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備取原兒茶酸、原兒茶醛對照品適量，精密稱定，置于同一容量瓶中，加甲醇制成分別含原兒茶酸15.86μg/ml和原兒茶醛 10.51μg/ml的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取樣品5g，精密稱定，精密加50ml乙酸乙酯，稱重，水浴回流30min，放冷，用乙酸乙酯補足重量，濾過，取續濾液25ml蒸干，加甲醇2ml使溶解并轉移置5ml量瓶中，加1%的冰醋酸至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3系統適用性實驗分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中分別呈現與對照品溶液色譜圖中保留時間相一致的兩色譜峰，原兒茶酸與原兒茶醛兩成分峰的分離度較好，與相鄰雜質峰完全分離,陰性無干擾。見圖1。

2.4線性關系試驗取“2.2.1”的對照品溶液，分別精密吸取5、10、15、20、25、30μl注入色譜儀，記錄色譜圖，以進樣質量數(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得原兒茶酸的回歸方程Y=4748.43767X-8.12860，r= 0.99999；原兒茶醛的回歸方程Y= 2003.05491X-4.81000，r= 0.99995。結果表明，原兒茶酸在0.0793～0.4758μg、原兒茶醛在0.00526～0.3153μg范圍內質量數與峰面積呈良好的線性關系。

2.5精密度實驗精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液20μl，連續進樣6次，記錄色譜圖，測定原兒茶酸、原兒茶醛的峰面積，計算原兒茶酸、原兒茶醛的RSD分別為0.22%、0.21%。實驗表明儀器的精密度良好。

2.6穩定性試驗精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液20μl，分別在0、6、10、16、22、25h各進樣一次，測定原兒茶酸、原兒茶醛的峰面積，原兒茶酸、原兒茶醛的RSD分別為0.22%、0.21%。表明供試品溶液在25h內穩定。

2.7重復性試驗取同一批號(130717)供試品，按“2.2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件測定，測得原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量分別為0.0211mg/g、0.0029mg/g，RSD分別為0.73%和1.23%(n=6)，表明此方法重復性良好。

2.8回收率試驗分別取原兒茶醛和原兒茶醛對照品29.31mg和11.45mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5.00ml置500ml量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。取同一批號(130717)的供試品5g，精密稱定，精密加對照品儲備液50ml，按“2.2.2”項下的方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液與對照品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，測定原兒茶酸、原兒茶醛的含量，計算回收率，結果見表1、2。測得原兒茶酸平均回收率97.01%，RSD=1.41%，原兒茶醛平均加樣回收率98.19%，RSD=1.82%。符合分析要求。

表2　原兒茶酸加樣回收結果

表3　原兒茶醛加樣回收結果

2.9樣品含量測定取5批樣品，按照供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件測定計算，結果見表4。

表4　樣品中原兒茶酸和原兒茶醛的含量測定結果

3討論

3.1測定指標選擇由金烏骨通膠囊的處方組成可知，要控制好該藥品質量，必須控制好處方中主藥質量，該藥品質量標準的研究中也以葛根、淫羊藿、姜黃、補骨脂等的活性成分測定，即葛根素、淫羊藿苷、姜黃素、補骨脂素和異補骨脂素等的含量測定來控制質量[7]。金毛狗脊、木瓜中含有原兒茶酸和原兒茶醛也是該藥品功效活性成分，有必要開展原兒茶酸和原兒茶醛含量測定指標，比文獻中采用薄層鑒別更好的控制該藥品質量。

3.2檢測波長的選擇[8]取原兒茶酸、原兒茶醛對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含原兒茶酸、原兒茶醛分別為10μg/mL的溶液，搖勻，照紫外分光光度法(2010年版中國藥典一部附錄VA)，在190～500nm 處掃描，溶液在256、280、320nm的波長處均吸收波長處有最大吸收，考慮到該樣品成分復雜性；結合從DAD檢測器收集的圖譜信息可知，原兒茶酸最大吸收波長為(256±2)nm，原兒茶醛最大吸收波長為(280±2)nm。當選擇280nm波長處測定，取樣量不變，則原兒茶酸幾乎檢測不到；而在256nm波長測定二者可兼顧，也不用增加取樣量，這樣減少對分析柱的污染，故選用256nm為檢測波長。

3.3流動相的選擇[9-11]采用甲醇-冰醋酸(90∶10)和乙腈-冰醋酸(95∶5)，試驗結果表明兩者均能達到分離效果，但由于該品種成分復雜，用單一的洗脫方式可以把原兒茶酸原兒茶醛分離，但對第二次進樣干擾嚴重，為了消除相互干擾，采用梯度洗脫增加有機相洗脫殘留成分，所以本方法采用甲醇-乙腈-1%冰醋酸按表1梯度洗脫達到消除進樣之間的相互干擾。

3.4提取方法的考察精密稱取樣品5g，加50ml乙酸乙酯提取，精密稱重，比較回流提15、30、60min的三個提取時間段，均用相應溶劑補足重量，濾過，取濾液25ml蒸干，加甲醇2ml使溶解并轉移置5ml量瓶中，用1%的冰醋酸定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液，結果表明，提取15min含量偏低，30、60min含量無明顯變化，為了省時采取回流30min。提取溶劑的選擇，比較甲醇乙醇提取溶劑，甲醇提取液顏色深，成分復雜，影響結果并易損壞色譜柱，乙醇提取含量偏低，故采用乙酸乙酯提取成分相對單一，便于分離檢測。

經方法學驗證，該檢測方法可以測定本品中原兒茶酸、原兒茶醛含量，具操作簡便、靈敏度高、能夠更好的克服其它物質的干擾、重復性和穩定性好等優點，可以有效的控制金烏骨通膠囊中金毛狗脊和木瓜藥材的質量。

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(收稿日期：2015.12.27)

【中圖分類號】R284.2

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)04-0029-02

作者簡介：萬紅才(1977-)，男，貴州甕安人，主管藥師，主要從事藥品檢驗。E-mail：397879050@qq.com通信作者：段萍(1964-)，四川渠縣人，副主任藥師，主要從事藥品檢驗。E-mail：DuanPing1964@qq.com

基金項目：2011-2012年度國家藥品標準提高研究課題基金(530)。