三七總皂苷對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及機制

盛國濤，李雙喜，莫小華(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明 650101)

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三七總皂苷對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及機制

盛國濤，李雙喜，莫小華(昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明 650101)

摘要：目的觀察三七總皂苷對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠的治療作用，并探討其機制。方法 選取SD大鼠30只，隨機分為假手術組(SO組)、重癥胰腺炎組(SAP組)、三七總皂苷干預組(PNS組)，每組各10只，經膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉制備大鼠SAP模型。SO組進腹后僅翻動胰腺和十二指腸后關腹，不注入5%牛磺膽酸鈉，其中PNS組模型建立后立即予腹腔注射三七總皂苷50 mg/mL，SO組、SAP組建模后注射生理鹽水0.1 mL/100 g。各組大鼠分別于建模后4 h檢測血清淀粉酶(AMS)，光鏡下觀察胰腺組織病理學改變，免疫組化SP法檢測胰腺組織中NF-κB及炎癥因子TNF-α表達。結果與SO組相比，PNS組和SAP組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學評分、NF-κB和TNF-α表達量顯著升高(P均<0.05)；與SAP組相比，PNS組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學評分、NF-κB和TNF-α表達量顯著降低(P均<0.05)；相關性分析結果顯示，胰腺組織腺泡細胞內NF-κB與TNF-α因子表達呈正相關(r分別為0.958、0.992、0.989，P均<0.05)。結論 三七總皂苷能減輕SAP的胰腺損傷，其機制可能為抑制胰腺組織NF-κB因子激活，減少炎性細胞因子過度釋放。

關鍵詞：重癥急性胰腺炎；三七總皂苷；核轉錄因子κB；腫瘤壞死因子α

重癥急性胰腺炎(SAP)在發病時除胰腺自身變化外，還會引起其他臟器功能異常，損傷胰外器官如肺、肝、腎等多種臟器，引發全身炎癥反應綜合征(SIRS)，甚至會發生多臟器功能衰竭(MOF)，病死率極高[1，2]，治療棘手。目前對胰腺炎的發病機制尚無明確解釋。隨著國內外眾多學者的深入研究，NF-κB因子過度激活被認為是炎癥反應發生發展的重要核心環節，抑制其活化可能有助于降低SAP的病死率。目前中藥在治療胰腺炎方面已取得較好效果，其中三七總皂苷目前研究較多。2015年7月，我們通過建立大鼠胰腺炎模型，給予三七總皂苷進行預干預，觀察三七總皂苷對SAP的治療作用，并探究其相關機制。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：清潔級SD大鼠30只，體質量200～250 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供。主要藥品與試劑：注射用三七總皂苷(血塞通注射液)購自云南植物藥業有限公司；牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司；10%水合氯醛由昆明醫科大學第二附屬醫院病理科提供；NF-κB p65多克隆抗體購自SANTA CRUZ公司。

1.2分組、造模及干預將30只SD大鼠隨機分為假手術組(SO組)、急性重癥胰腺炎組(SAP組)、三七總皂苷干預組(PNS組)3組，每組10只。SAP組、PNS組動物模型使用并改良經腸壁逆行胰膽管注射法，術前禁食24 h，但不禁水。術前使用生理鹽水將牛磺膽酸鈉(ST)配制成5%的ST溶液，用于建模。準備好血塞通注射液。使用乙醚吸入麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定大鼠于手術臺上。腹部常規備皮、消毒、鋪巾，作手術標記。取上腹部正中切口長1～2 cm，逐層入腹，翻動十二指腸尋找大鼠胰膽管，探查十二指腸乳頭位置，明確胰膽管走行。辨認十二指腸降部腸管壁內潛行的胰膽管，用無損傷絲線結扎肝門處膽管，辨認出十二指腸乳頭處，使用針頭在其對側腸壁穿刺后退針。用預先去尖鈍針頭1 mL注射器插入腸腔，探查十二指腸乳頭，經十二指腸乳頭逆行穿刺入胰膽管并向前推進約0.5 cm，針頭使用無損傷血管夾固定。以0.2 mL/min的速度向胰膽管內注入5% ST(0.1 mL/100 g)，注射完畢后2～3 min肉眼觀察確認大鼠胰腺組織水腫，顏色變為磚紅色或灰白色等改變，即建模成功，拔出注射針頭前解開結扎在肝門部的無損傷絲線。皮下注射生理鹽水(0.1 mL/100 g)補液，逐層關腹。其中SO組模型制作：進腹后僅翻動胰腺和十二指腸后關腹，不注入5%牛磺膽酸鈉；PNS組模型制作：建模方式與SAP組相同，但在關腹前使用50 g/mL血塞通注射液(0.1 mL/100 g)注入腹腔后逐層關腹。SO組及SAP組大鼠腹腔內注射等量生理鹽水(0.1 mL/100 g)。在建模后4 h處死大鼠，心臟采血，經腹腔取胰腺組織標本。

1.3血清淀粉酶(AMS)檢測心臟采血，采血量約5 mL。將血清離心15 min，-80 ℃下保存。采用全自動生化分析儀檢測血清AMS。

1.4胰腺組織病理學評分經腹腔取胰腺組織，取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm胰腺組織用10%甲醛溶液固定，送往昆明醫科大學第二附屬醫院病理科，由病理科醫師進行蘇木素-伊紅染色。光鏡下觀察并采用改良的Grewal和Schmidt等方法對SAP大鼠胰腺組織損傷進行定量評估。

1.5胰腺組織腺泡細胞內NF-κB和TNF-α表達檢測 采用免疫組化SP法檢測胰腺組織細胞內NF-κB和TNF-α因子表達，操作按試劑盒說明書進行。胰腺組織細胞質和細胞核或細胞膜染有棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，結果采用圖像分析軟件Image pro plus進行分析，測平均光密度，通過平均光密度值反映胰腺組織內NF-κB、TNF-α表達量。

2結果

2.1三組血清AMS水平比較SO組、SAP組、PNS組血清AMS水平分別為(885.2±202.33)、(3 134.12±331.05)、(2 661.15±324.72)U/L，三組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2三組胰腺組織病理學評分比較SAP組、PNS組大鼠胰腺組織均出現腫脹、滲出、點狀出血壞死。SO組、SAP組、PNS組胰腺組織損傷評分分別為(2.3±0.47)、(13.1±1.35)、(6.7±1.29)分，三組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3三組胰腺組織中NF-κB/p65陽性細胞、TNF-α表達比較SO組、SAP組、PNS組NF-κB /p65陽性量分別為(33.16±3.22 )、(72.20±7.76)、(47.28±3.72)Pu，TNF-α表達量分別為0.079±0.011、0.334±0.018、0.145±0.009，三組間兩兩比較，P均<0.05。

2.4胰腺組織腺泡細胞內NF-κB與TNF-α表達的相關性SO組、SAP組、PNS組胰腺組織腺泡細胞內NF-κB與TNF-α表達存在正相關性(r分別為0.958、0.992、0.989，P均<0.05)。

3討論

SAP作為外科常見的急腹癥，病情發展兇險，病死率較高，臨床治療棘手。造成SAP治療瓶頸的主要原因是其發病機制復雜，目前尚未明確。研究表明，SAP在病程早期由于胰酶的大量釋放，損傷胰腺細胞及小血管壁，引起多種炎癥介質的釋放，改變血管通透性導致胰腺水腫、出血、壞死，繼而引發嚴重的SIRS和多器官功能不全綜合征(MODS)等[3]。

“細胞因子和炎癥介質”是人們在SAP研究中發現并了解較早的致病因素。大量研究表明，部分炎癥介質和細胞因子在體內含量的多少與SAP病情輕重和最終病死率呈正相關。目前關于炎癥學說的研究已較為成熟，大量的細胞因子和炎癥介質中以TNF-α與SAP的關系最為密切。TNF-α是由機體內各種炎癥細胞如T淋巴細胞、肥大細胞、巨噬細胞、單核細胞產生的。其主要作用可通過對機體免疫功能的影響，使機體腫瘤細胞受到干擾，同時還可通過調節細胞的代謝功能來影響正常細胞的生長和分化。在SAP病情發展中，TNF-α起重要作用。在對臨床100例患有SAP的患者進行研究發現[4]，在患病90 d內由于各種并發癥死亡的患者入院時血清TNF-α含量是死亡患者的63倍；同時發現SAP合并有MODS較單純的SAP患者血清中TNF-α含量高出191.5倍。可見TNF-α是反映SAP嚴重輕度及預后情況的較好指標。TNF-α在各種炎癥反應中均起到重要作用，其可破壞上皮組織的保護屏障，增加其通透性。這樣可使其他炎癥介質、炎癥細胞通過屏障到達炎癥組織，最終導致炎癥反應加重，組織損傷[5]。NF-κB由Sen等[6]于1986年在B淋巴細胞核中提取并檢測出來，其在SAP發病過程中對炎癥的發生發展起到重要作用。在SAP反應中NF-κB可激活大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子、白細胞介素、趨化因子、黏附分子和集落刺激因子等炎癥因子，可促進瀑布炎癥反應[7，8]。

近年來，運用中藥及天然藥物治療SAP在動物和臨床實驗方面均取得一定進展[9]。本實驗結果顯示，與SO組相比，PNS組和SAP組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學評分、NF-κB和TNF-α表達量顯著增高；與SAP組相比，PNS組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學評分、NF-κB和TNF-α表達量顯著降低；相關性分析結果顯示胰腺組織腺泡細胞內NF-κB與TNF-α因子的表達呈正相關，提示三七總皂苷注射液可能通過抑制NF-κB表達，從而抑制TNF-α等炎性因子的分泌，有助于SAP的治療。當前大量的臨床觀察和實驗研究表明三七總皂苷在胰腺炎的治療方面有著較顯著效果。有學者[10]使用烏司他丁聯合三七總皂苷治療SAP大鼠，觀察大鼠血清中TNF-α和IL-1β在組織中表達，結果發現SAP大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β表達明顯升高，單獨三七總皂苷和烏司他丁均可抑制其表達，但以兩者聯用的治療效果最為理想，說明三七總皂苷對SAP治療效果可通過抑制炎癥反應實現。

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Effect of panax notoginseng saponins in treatment of rats with severe acute pancreatitis

SHENGGuotao,LIShuangxi,MOXiaohua

(TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponins in treatment of rats with severe acute pancreatitis (SAP), and to explore the mechanism.MethodsThirty SD rats were randomly divided into three groups: sham operation group (SO group ), severe acute pancreatitis group (SAP group), PNS preconditioning group (PNS group), and there were 10 rats in each group. Rat SAP models were induced by retrograde injection of 5% taurocholic acid sodium to pancreatic duct. SO group was just treated with pancreas and duodenum turning after abdominal closure without injection of 5% taurocholic acid sodium. The rats in the PNS group were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/100 g PNS 50 mg/mL (xuesetong injection 0.1 mL/100 g) after the models were established. And rats in the other two groups were given normal saline (0.1 mL/100 g). The serum AMS were detected at 4 hours after modeling, we observed the pathological changes of pancreatic tissues under the light microscopy. The expression of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) was detected by immunohistochemical SP method.ResultsCompared with the group SO, serum AMS levels, pathology scores of pancreatic tissues and the expression of NF-κB and TNF-α were significantly increased in the groups PNS and SAP (all P<0.05), and those in the SAP group rats were significantly higher than those in the PNS group (all P<0.05). The expression of NF-κB was positively correlated with TNF-α expression in the pancreas acinar cells (r=0.958, 0.992 and 0.989, all P<0.05).ConclusionsPanax notoginseng saponins may reduce the pancreatic injuries of SAP rats. Panax notoginseng saponins may have protective effect on SAP rats by inhibiting the activation of NF-κB and reducing the excessive release of inflammatory factors.

Key words:severe acute pancreatitis; panax notoginseng saponins; nuclear transcription factor-κB; tumor necrosis factor-α

(收稿日期：2015-11-17)

中圖分類號：R576

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.006

通信作者簡介：莫小華(1963-)，教授，主任醫師，主要研究方向為胰腺疾病。E-mail:120638905@qq.com

第一作者簡介：盛國濤(1989-)，在讀碩士研究生，主要研究方向為肝膽胰外科學臨床治療。E-mail:1454846616@qq.com

基金項目：昆明醫科大學聯合專項基金資助項目(2007C138M)；昆明醫科大學研究生創新基金資助項目(2015S91)。