RNA干擾大腸癌相關(guān)信號(hào)通路基因表達(dá)的研究進(jìn)展

劉蓮花，劉模榮，董輝，金海，文國(guó)榮，徐靖宇(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

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·綜述·

RNA干擾大腸癌相關(guān)信號(hào)通路基因表達(dá)的研究進(jìn)展

劉蓮花，劉模榮，董輝，金海，文國(guó)榮，徐靖宇(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

摘要：基因沉默指外源性基因在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)。RNA干擾屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在基因功能研究上，RNA干擾已成為最強(qiáng)大的基因剔除遺傳工具。近年來(lái)，對(duì)與大腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的相關(guān)信號(hào)通路研究日益增多，其中wnt/β-catenin、STATS信號(hào)通路、TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、RAS/MARK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、磷脂腺激醇3-激酶等信號(hào)通路的異常改變?cè)诖竽c癌發(fā)生及發(fā)展中最常見。RNAi有高效性及特異性的特點(diǎn)，在腫瘤治療中廣泛應(yīng)用。RNAi對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用包括靶向預(yù)制外源基因和內(nèi)源基因。通過(guò)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多個(gè)基因的共同序列抑制多個(gè)基因表達(dá)，并通過(guò)干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)制大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：大腸癌；基因沉默；RNA干擾；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2014年美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，大腸癌已成為全球僅次于乳腺癌和肺癌最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率因地區(qū)不同而存在較大差異[1]。因大腸癌早期無(wú)明顯特異性臨床癥狀及體征，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，目前主要采取手術(shù)治療為主、放化療為輔的治療方式，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的大腸癌治療效果及預(yù)后均不佳[2]。隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，RNA干擾(RNAi)作為一種生物分子技術(shù)在腫瘤疾病治療領(lǐng)域得到重視。研究表明降低腫瘤的發(fā)生率，提高癌癥治療效果及改善癌癥患者生存率可通過(guò)RNAi及有效敲除腫瘤基因的表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)[3]，因此進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn)已成為提高大腸癌患者生存率及改變其生存率的重點(diǎn)問(wèn)題。

1RNAi的研究背景及作用機(jī)制

基因沉默是調(diào)控真核生物細(xì)胞基因表達(dá)的手段，指因外源基因在轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)并未丟失或損傷，但該基因不表達(dá)或表達(dá)量極低的現(xiàn)象。RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，RNAi主要作用機(jī)制是基因表達(dá)的相應(yīng)mRNA被小片段雙鏈RNA(dsRNA)高效特異性降解,從而特異性阻斷相應(yīng)基因表達(dá)[4]。研究者于1995年在對(duì)線蟲的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)正義RNA與反義RNA均可阻斷par-1表達(dá)，稱為RNAi。Fire等證明RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，之后RNAi在植物及哺乳動(dòng)物體內(nèi)相繼被發(fā)現(xiàn)。RNAi是由特定小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，其中小RNA包括內(nèi)源性微小RNA(micRNA)、外源性小干擾RNA(siRNA)或短發(fā)卡RNA(shRNA)[5]，根據(jù)靶dsRNA的合成方法將RNAi技術(shù)分為體外化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、體內(nèi)載體合成法三種。近年來(lái)，在基因功能研究上，RNAi已成為最廣泛及最強(qiáng)大的基因剔除工具，成為腫瘤相關(guān)疾病的治療熱點(diǎn)。RNAi具有高效性和特異性的特點(diǎn)，成為大腸癌基因治療研究領(lǐng)域的新方法。RNAi技術(shù)中特異性的siRNA載體分兩類：①病毒siRNA表達(dá)載體，如慢病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等。②siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體或陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹的siRNA。因siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率低及陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹的siRNA具有細(xì)胞毒性，而病毒siRNA 表達(dá)載體因有較低的免疫原性及細(xì)胞毒性，已成為基因治療研究領(lǐng)域的理想工具。有研究證實(shí)RANi的作用機(jī)制可能與部分酶和蛋白有關(guān)，如RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)、dsRNA 特異性核酸內(nèi)切酶(Dicer)、Argonaute 蛋白等。通過(guò)研究這些酶與蛋白在細(xì)胞基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步闡明RNAi可能的作用機(jī)制與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)有關(guān)：①RISC是由siRNA與核酸內(nèi)外切酶、解旋酶、ATP、 Argonaute蛋白連接在一起形成有多個(gè)亞單元沉默復(fù)合體。通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)將dsRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，較長(zhǎng)的dsRNA在細(xì)胞體內(nèi)通過(guò)Dicer的RNA酶Ⅲ樣特異性核酸內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生21～23 nt 的siRNA，5′-磷酸和3′-羥基分別分布于siRNA兩條單鏈末端，且 3′端均有2～3個(gè)突出的核苷酸，能與其他蛋白質(zhì)及酶結(jié)合 形成RISC。RISC中的降解酶應(yīng)用ATP解開siRNA雙鏈，使靶向的mRNA上與之相匹配的特異性序列與解開的siRNA 反義互補(bǔ)結(jié)合，RISC中的核酸降解靶細(xì)胞中的mRNA，從而使目的基因沉默，即產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。②siRNA亦可與RISC和mRNA結(jié)合在一起，在siRNA雙鏈被接開后，反義RNA鏈以 mRNA 為模板作為雙鏈 RNA 合成的一個(gè)引物，在RdRP作用下形成新的dsRNA ,再次被 Dicer 識(shí)別并切割,形成新的siRNA 再循環(huán)，這樣不斷放大的作用形式能作用于其他更多的靶向mRNA，使siRNA在短時(shí)間內(nèi)快速并有效抑制靶向基因蛋白質(zhì)或多肽的合成。

目前RNA干擾存在的問(wèn)題：①在構(gòu)建siRNA序列過(guò)程中，如何找到效果最好的siRNA序列。②如何提高所構(gòu)建的特異性siRNA轉(zhuǎn)染效率。③如何解決外源性的siRNA在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及拮抗效應(yīng)[6]。④如何減少siRNA在體內(nèi)的脫靶效應(yīng)等。

2影響大腸癌發(fā)生的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

大腸癌相關(guān)信號(hào)通路的異常與大腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。影響大腸癌的相關(guān)信號(hào)通路有Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、STATS信號(hào)通路、TGF-β/Smads信號(hào)通路、RAS/MARK信號(hào)通路、絲裂原蛋白激酶信號(hào)通路(ERK-MAPK信號(hào)通路)、mTOR信號(hào)通路、TGF-β/Smad4信號(hào)通路、水通道蛋白-5(AQP-5)、凋亡及細(xì)胞核因子-κBp65(NF-κB p65)信號(hào)通路、磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、MAPKs/NF-1κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、hedgehog信號(hào)通路、BMP7-Ids信號(hào)通路等。其中wnt/β-catenin、STATS信號(hào)通路、TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、RAS/MARK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、磷脂腺激醇3-激酶等信號(hào)通路的異常改變?cè)诖竽c癌發(fā)生及發(fā)展中最常見。RNAi有高效性及特異性的特點(diǎn)，在腫瘤治療中廣泛應(yīng)用。RNAi對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用包括靶向預(yù)制外源基因和內(nèi)源基因。通過(guò)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多個(gè)基因的共同序列抑制多個(gè)基因表達(dá)，并通過(guò)干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[7，8]。

3RNA干擾Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)

Wnt/β-catenin是腫瘤細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵的信號(hào)通路之一，尤其在大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及分化中起重要作用。其通過(guò)穩(wěn)定β-catenin蛋白[9]，從而促進(jìn)基因表達(dá)及細(xì)胞增殖。調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白如Axin2、APC及β-catenin的異常改變，使Wnt/β-catenin不能被磷酸化及降解，Wnt/β-catenin在大腸癌細(xì)胞中大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF-LEF結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，使該通路在無(wú)Wnt刺激的狀態(tài)下仍能處于激活狀態(tài)，從而激活相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄且對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。抗凋亡蛋白bcr與β-catenin結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)β-catenin激活的轉(zhuǎn)錄基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。有學(xué)者通過(guò)構(gòu)建β-catenin的siRNA轉(zhuǎn)染到大腸癌細(xì)胞HCT166和SW480中，后通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)出被siRNA感染的大腸癌細(xì)胞HCT166和SW480分別存在β-catenin和APC突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后的兩株大腸癌細(xì)胞中β-catenin和β-catenin相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低，且癌細(xì)胞增殖明顯受抑[10,11]。Ressd等通過(guò)將bcr的siRNA敲出基因轉(zhuǎn)染到大腸癌HCT-166細(xì)胞株內(nèi)，激活了轉(zhuǎn)錄基因c-myc表達(dá)，證實(shí)bcr在Wnt信號(hào)通路中可作為腫瘤抑制基因。

4RNA干擾PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)

PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大腸癌細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移及血管新生中起重要作用，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是由一個(gè)催化亞基p110h和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。已有研究表明，p85和Akt2在大腸癌腺體中呈高表達(dá)。在正常細(xì)胞中，抑癌基因PTEN可抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但在大腸癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)下降，使PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制受限，從而導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力得不到很好的控制。Rychahou等分別用p110和p85的siRNA轉(zhuǎn)染至人大腸癌KM20和HT-29細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞凋亡增加及增殖能力下降。

5RNA干擾TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)

TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為TGF-β經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與大腸癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡密切相關(guān)。TGF-β即轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子β，是生長(zhǎng)因子超家族中的一種，近期研究表明TGF-β1可通過(guò)抑制大腸腫瘤對(duì)免疫細(xì)胞的滲透作用逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視而促進(jìn)腫瘤形成[12]。TGF-β1也可調(diào)節(jié)血管的生成從而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。TGF-β對(duì)大腸癌細(xì)胞的增生或凋亡作用決定癌細(xì)胞的變異情況。Smads復(fù)合物通過(guò)與不同的DNA結(jié)合蛋白或共轉(zhuǎn)錄因子相互作用，Smads的變異可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其中Smad4蛋白是該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，其變異可使TGF-β/Smad轉(zhuǎn)變成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。通過(guò)構(gòu)建Smad4-shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸癌細(xì)胞HCT-166細(xì)胞中，Smad4基因沉默后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖力及侵襲能力明顯增強(qiáng)，早期凋亡率明顯降低，S期細(xì)胞增多，且Smad4基因可能與大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

6RNA干擾 STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)

STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，其中STAT-6、STAT-3均屬于信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員[14]。STAT是生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及非受體酪氨酸激酶等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶的匯集焦點(diǎn)，該信號(hào)通路的過(guò)度激活使其下游靶基因的調(diào)節(jié)異常，從而使大腸癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡產(chǎn)生異常，導(dǎo)致腫瘤形成。STAT6信號(hào)通路可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。張明生等通過(guò)沉默STAT6特異性基因，構(gòu)建Sh質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人大腸癌HT-29細(xì)胞株中，從而阻斷STAT6信號(hào)通路的傳導(dǎo)，后試驗(yàn)證明被轉(zhuǎn)染過(guò)STAT6特異性shRNA的大腸癌細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)明顯減少，Bax蛋白基因增多，癌凋亡明顯增加[15]。Qian等[16]通過(guò)構(gòu)建針對(duì)STAT3基因的shRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中，試驗(yàn)證實(shí)通過(guò)特異性沉默STAT3基因表達(dá),可有效地抑制大腸癌細(xì)胞增殖，并使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0、G1期并誘導(dǎo)其凋亡，癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

7RNA干擾RAS/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)

RAS蛋白包括K-RAS、N-RAS及H-RAS，多數(shù)大腸癌中均有K-RAS變異[17]，其中主要表現(xiàn)為B-RAF及K-RAS變異,導(dǎo)致GTP不能水解[18]，使RAS-GTP處于持續(xù)活化狀態(tài)，從而導(dǎo)致RAS/MAPK信號(hào)通路活性增強(qiáng)，最終激活絲裂原活化蛋白激酶MAPK，從而促進(jìn)大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。研究者通過(guò)Rac1-shRNA載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸細(xì)胞株(LoVo、SW480、SW620、SW1116、HT29)，后試驗(yàn)表明以上被轉(zhuǎn)染特異性Rac1-shRNA大腸癌細(xì)胞侵襲移動(dòng)能力受到抑制，癌細(xì)胞中Rac1蛋白不表達(dá),細(xì)胞周期進(jìn)程受抑制,阻滯于G0、G1期，細(xì)胞凋亡明顯增加。

8RNA干擾新型鈣離子轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達(dá)

瞬時(shí)性受體電位通道(TRP)超家族中，TRPV是其超家族中的重要成員之一，其中TRPV5、TRPV6是TRPV中惟一已知鈣離子高選擇性通道，在有鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的器官中表達(dá)，其中主要表達(dá)于前列腺、乳腺、腎臟、小腸上皮等器官中，而人結(jié)腸癌細(xì)胞株(Sw480)中亦有表達(dá)，TRPV6表達(dá)高于TRPV5表達(dá)，在早期結(jié)腸癌中TRPV6有66%過(guò)表達(dá)[19]。有研究認(rèn)為鈣缺乏可促進(jìn)TRPV6在小鼠十二指腸黏膜的表達(dá)[20]，促進(jìn)鈣的吸收對(duì)結(jié)腸癌有防御作用[21]。有學(xué)者通過(guò)用TRPV6特異性siRNA轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖減少40%，且細(xì)胞凋亡增加了原本的兩倍以上[22,23]。亦有試驗(yàn)表明，通過(guò)激動(dòng)劑25(OH)2D3和抑制劑劑(CuCl2)的作用可使大腸癌細(xì)胞凋亡增加，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子明顯增加，與既往增加鈣離子的吸收可預(yù)防結(jié)腸癌報(bào)道說(shuō)法不同。對(duì)于在結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的TRPV6來(lái)說(shuō)，可通過(guò)構(gòu)建TRPV6特異性shRNA暫無(wú)進(jìn)一步研究。進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明新型鈣離子通道與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡等形態(tài)變化，是否與鈣離子的增加或減少有直接聯(lián)系仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，有多數(shù)研究是通過(guò)阻斷信號(hào)通路，影響大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)所需物質(zhì)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的生成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。部分研究證實(shí)RNA干擾相關(guān)信號(hào)通路基因的表達(dá)而使抑癌基因處于激活狀態(tài)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移。也有部分研究表明阻斷信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞的增殖或遷移并無(wú)直接影響，而是通過(guò)影響該基因上游或下游基因的表達(dá)從而影響癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展。RNAi的出現(xiàn)為我們?cè)谖粗蚬δ艿臋z測(cè)上提供重要的手段。大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移或凋亡與相關(guān)信號(hào)通路變化密切相關(guān)，了解相關(guān)信號(hào)通路對(duì)與癌細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制，對(duì)大腸癌的預(yù)防和治療起到重要作用。

結(jié)合近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者在RNAi技術(shù)研究結(jié)果，本文對(duì)既往在RNAi技術(shù)上存在的部分問(wèn)題進(jìn)行梳理：特異性siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，能否保證siRNA的穩(wěn)定性，研究證實(shí)高密度脂蛋白納米粒子明顯改善裸體siRNA的穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)[24,25]。

隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，RNAi從體外細(xì)胞的培養(yǎng)研究模式走向?qū)嶓w試驗(yàn)，甚至將RNAi用于作為大腸癌的有效治療手段都指日可待，對(duì)于臨床試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，如何選擇一個(gè)最佳生物安全水平是至關(guān)重要的。對(duì)于有多基因參與的腫瘤相關(guān)疾病，siRNA適合的治療量及能否用多個(gè)基因的siRNA來(lái)治療腫瘤也是有待于進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

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本刊2016年第56卷第5期“BNP聯(lián)合心肌酶譜檢測(cè)對(duì)冠心病危險(xiǎn)分層和冠脈搭橋術(shù)療效的預(yù)測(cè)作用”一文的作者及單位更改為：劉志強(qiáng)1，2，劉寅1，楊劉順2，李英偉2，孫樹申2(1 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2 天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院)；通信作者：劉寅(E-mail： 1637767441@qq.com)。特此聲明。

本刊編輯部

(收稿日期：2015-11-28)

中圖分類號(hào)：R735.34

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0092-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.037

通信作者：劉模榮(E-mail:zylmr@163.com)

基金項(xiàng)目：貴州省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合G字(2014)7014號(hào))。