基于HepG2體外細胞培養的旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝

黃一凡， 王 帥，2，3， 孟憲生，2，3*， 包永睿，2，3

（1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧大連116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧大連116600）

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基于HepG2體外細胞培養的旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝

黃一凡1， 王 帥1，2，3， 孟憲生1，2，3*， 包永睿1，2，3

（1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧大連116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧大連116600）

摘要:目的 優選旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝。方法 采用正交實驗設計，對影響提取工藝的3個因素（提取時間、提取次數、乙醇用量）進行考察，以腫瘤抑制率為考察指標來優選最佳提取工藝。同時結合層次分析法，優選以總黃酮含有量和出膏率為綜合評價指標的權重系數及其范圍，并采用Pearson相關性分析對其進行驗證。結果 最佳工藝條件為20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。以總黃酮含有量和出膏率為指標的綜合權重系數范圍為0.75～0.90、0.10～0.25。結論 該優化工藝在保證藥效的前提下，簡化了考察指標，避免了復雜的操作，可為其他中藥材有效組分提取工藝的優選提供了思路和方法。

關鍵詞:旋覆花；抗腫瘤；正交設計；層次分析；抑制率；權重系數

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.050

旋覆花為菊科植物旋覆花Inula jaPonica Thunb.或歐亞旋覆花Inula britannica L.的干燥頭狀花序［1］，其化學成分主要有黃酮類、倍半萜內酯類、三萜、甾體和揮發油成分［2］，具有抗炎、保肝、抗腫瘤等多種生物活性。已有文獻報道，旋覆花的抗氧化活性與其含有的黃酮有關［3］，但未見其抗腫瘤方面的相關報道。本實驗基于HePG2細胞體外藥效實驗，通過正交實驗設計，以腫瘤細胞抑制率為指標，對旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝進行篩選，并結合層次分析法，優選可代替藥效指標綜合評分的權重系數，為該植物的合理開發和利用奠定基礎。

1 儀器和材料

UV-1750紫外可見分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；Sunrise型酶標儀（奧地利Tecan公司）；UAIRETM US Autof1ow型CO2培養箱（美國Nuaire公司）。

旋覆花藥材購自大連民大中藥飲片有限公司，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為歐亞旋覆花Inula britannica L.的干燥頭狀花序。蘆丁（含有量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號100080200707）。DMEM培養粉、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、胎牛血清（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司）；人肝癌細胞株HePG2（大連醫科大學）。所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 旋覆花總黃酮含有量的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.20 mg的溶液，即得。

2.1.2 檢測波長的選擇 取對照品溶液和正交試驗中的1號樣品溶液（15倍55％乙醇提取1 h一次，總黃酮含有量為7.246％）各2 mL，置于25 mL量瓶中，加入5％亞硝酸鈉（現配）1 mL，放置6 min，再加入10％硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加入4％氫氧化鈉10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁的試液為空白對照，于400～800 nm處掃描。結果，對照品溶液和樣品溶液均在510 nm處有最大吸收，故確定510 nm作為檢測波長［4-5］。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項下方法操作，以蘆丁的質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線，回歸方程為Y=12.41X+0.004 6，r=0.999 5，表明蘆丁在0.012～0.048 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 HePG2細胞培養與藥效學檢測

2.2.1 細胞培養 細胞株培養于含10％胎牛血清的DMEM培養液中（含青鏈霉素100 U/mL），于37℃、5％ CO2培養箱內連續培養。細胞長滿后，用0.25％胰蛋白酶消化，傳代培養。

2.2.2 MTT法細胞抑制率檢測 取處于對數生長期、生長狀態良好的HePG2細胞，用胰酶制成細胞懸液并計數，調整細胞密度為5×104/mL，加入96孔培養板中，每孔100 μL，于37℃，5％CO2飽和濕度下培養24 h后，實驗組加入樣品溶液100 μL（每組設5個復孔），空白對照組加入等體積的培養液。繼續培養24 h后，避光下每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續孵育4 h，棄除上清液，每孔加入DMSO150 μL，搖床上振搖10 min后，于酶標儀492 nm處測定吸光度（A值），計算藥物對細胞的增殖抑制率。抑制率=（1-試驗組A值/對照組A值）×100％。

2.3 提取工藝的考察

2.3.1 醇濃度單因素考察 對0％、35％、55％、75％、95％乙醇進行考察，其總黃酮含有量分別為4.71％、6.61％、7.10％、6.17％、2.15％。結果表明，55％乙醇對旋覆花中總黃酮類成分的提取率最高，因此選用55％乙醇作為最佳提取溶劑。

2.3.2 提取工藝的正交實驗設計 精密稱取旋覆花粉末10 g，以55％乙醇為提取溶劑進行提取。選擇提取時間、提取次數、乙醇用量作為考察因素［6］，各因素取3個水平，以細胞抑制率為指標，進行L9（34）正交試驗考察。稱取9組正交設計的提取物粉末（相當于0.1 g生藥材）溶解，2‰DMSO助溶，0.22 μm微孔濾膜濾過，作用于HePG2細胞，以細胞抑制率為指標，優選提取工藝，結果見表1和表2。

表1　正交試驗設計及直觀分析結果

表2　正交試驗方差分析

以細胞抑制率為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為B＞C＞A，其中提取次數（B）、乙醇用量（C）對細胞抑制率影響較大，而且有顯著性差異（P＜0.05）。另外，提取次數為3次時，已達到工廠日工作量，因此不再增加提取次數，確定最佳提取次數為3次。由于乙醇用量（C）也是影響提取工藝的主要因素，故為驗證優選乙醇用量的準確性，在其他提取條件均為最優時，對其進行單因素考察。

分別對17.5、20、22.5倍乙醇用量進行單因素考察，發現細胞抑制率分別為62.79％、65.17％、65.19％，即乙醇用量為20倍時，細胞抑制率明顯高于17.5倍，而與22.5倍的抑制率相差不大。因此，從節約溶劑的角度考慮，確定溶劑用量為20倍。

綜上所述，篩選出的最佳提取條件為A1B3C2，即20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。

2.4 層次分析法對總黃酮含量和出膏率權重系數的確定以總黃酮含有量和出膏率為指標，評價旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝，建立評價目標樹圖，結果見圖1。

圖1　旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的評價目標樹

通過比較同一層次目標（即總黃酮含有量和出膏率）的相對重要程度，構成一系列兩兩比較矩陣。通過AHP軟件，計算權重系數隨機一致性比率CR（CR=CI/RI），其可作為衡量所得權重系數是否合理的指標。通過軟件，得到9組CR=0.000 0＜0.1，即認為矩陣具有滿意的一致性，表明9組權重系數合理有效，可用于提取工藝優選的綜合評分中，見表3。

表3　兩種指標在不同重要程度下的權重系數

按照各指標不同的權重系數來計算綜合評分，作為提取工藝的評價指標，以“比較重要”為例（總黃酮含有量和出膏率的權重系數分別為0.833 3、0.166 7、0.166 7、0.833 3），實驗設計和結果見表4和表5［綜合評分1 =（總黃酮含有量/最大總黃酮含有量）×0.833 3 +（出膏率/最大出膏率）×0.166 7；綜合評分2 =（總黃酮含有量/最大總黃酮含有量）×0.166 7 +（出膏率/最大出膏率）×0.833 3）］。

表4　正交試驗設計及直觀分析結果

表5　正交試驗方差分析

以綜合評分1為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為B＞C＞A，其中提取次數（B）影響最大，而且有顯著性差異（P＜0.05）。另外，提取次數為3次時已達到工廠日工作量，因此不再增加提取次數，確定最佳提取次數為3次。另外，乙醇用量和提取時間無顯著性差異（P＞0.05），而且20倍和25倍乙醇用量相差不大，從節約溶劑角度考慮，確定乙醇用量為20倍；提取時間也相差不大，因此為提高生產效率、節約成本，確定提取時間為1 h。綜上所述，最佳提取條件為A1B3C2，即20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。

以綜合評分2為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為B＞A＞C，各因素均無顯著性差異（P＞0.05）。從提高生產效率和節約溶劑角度考慮，優選出的工藝條件為A3B2C2，即20倍量55％乙醇，回流提取2次，每次3 h。

當總黃酮含有量和出膏率的權重系數分別為0.833 3、0.166 7時，以綜合評分與細胞抑制率為指標優選的最佳提取條件一致，說明在此權重系數下，兩者的綜合評分可代替抑制率，作為旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的考察指標。當權重系數為0.166 7、0.833 3時，與以藥效為指標優選出的提取工藝不一致。

同時，對其它7組權重系數計算綜合評分，進行正交試驗直觀分析和方差分析，得到總黃酮和出膏率最佳的權重系數范圍分別為0.75～0.90、0.10～0.25。在此權重系數范圍內，其綜合評分可代替抑制率，作為提取工藝的考察指標。

2.5 驗證試驗 平行稱取3份等量藥材，按照優選出的最佳提取工藝進行提取，按“2.1”、“2.2”項下方法驗證提取工藝的穩定性。結果，總黃酮含有量為8.952％、8.810％、8.783％，出膏率為20.87％、21.16％、20.17％，細胞抑制率為63.13％、65.76％、66.48％，3項指標的RSD分別為1.03％、2.45％、2.71％，說明優選的提取工藝穩定可行，而且藥效學結果穩定。

選取2個權重系數范圍內外的數值，對其綜合評分分別與細胞抑制率進行Pearson相關性分析［7-10］，確定權重系數范圍的準確性和合理性，結果見表6。

表6　權重系數范圍驗證結果

由表可知，在確定的權重系數范圍內，綜合評分與細胞抑制率的相關系數較大；在權重系數范圍外，相關系數較小，說明總黃酮含有量和出膏率的權重系數范圍是合理的。

3 討論

旋覆花為常用的止咳化痰、降逆止嘔中藥，臨床療效顯著，同時具有抗炎、抗肝炎、抗肝損傷、抗腫瘤等多種生物活性。由于文獻并沒有其在抗腫瘤有效組分提取工藝方面的報道，因此本實驗對其進行研究，為開發以旋覆花為原料的，具有廣泛臨床使用價值和商業開發價值的抗癌新藥提供理論和實驗依據。

中藥化學成分復雜，每味中藥相當于一個復方，包含各種化學物質組，其之間相互影響，同時各有效物質組內單體成分之間也有相互影響，因此有效組分的含有量與藥效之間并不呈完全線性相關。若只單純以有效組分或指標性成分的含有量為提取工藝的考察指標，不能保證優選的提取工藝所提組分的藥效能夠達到最佳，存在片面性；若以細胞抑制率為評價指標，雖能保證提取工藝的藥理藥效，但操作復雜、耗時。因此，本實驗針對中藥多組分、復雜性的特點，運用多指標綜合評價方法［11-14］中常用的層次分析法，將旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的評價目標構成單層次、兩指標體系，在主觀判斷的基礎上作進一步數學處理，使其在權重系數的賦予上更加科學、合理，同時建立總黃酮含有量、出膏率與藥效的關聯，即以抑制率為指標的正交試驗結果，優選代替抑制率的總黃酮含有量和出膏率綜合指標的權重系數及其范圍。本實驗篩選出影響評價目標（提取工藝）的主要和次要相關指標，避免了工業生產中賦予權重系數的偶然性，不僅能確保提取工藝的藥理藥效，還簡化了考察指標，避免操作的復雜性，使優選的工藝更加合理可行，為旋覆花抗腫瘤有效組分提取工藝的優選提供方便。

通過Pearson相關性分析，當總黃酮含有量和出膏率的權重系數為0.80、0.20時，其與抑制率的相關系數為0.850 7；當兩者為0.20、0.80時，相關系數為0.684 9。由此可知，在確定的權重系數范圍內，綜合評分與細胞抑制率的相關系數較大；在權重系數范圍外，相關系數較小，驗證了綜合評分權重系數范圍的合理性，同時證明了總黃酮含有量的相對出膏率更為重要，在合理的權重系數范圍內，其綜合評分可代替藥效指標，作為其抗腫瘤有效組分提取工藝的評價指標。總黃酮含有量和細胞抑制率的相關系數為0.862 5，兩者呈一定的相關性，即量效關系，說明總黃酮類成分為其抗腫瘤的有效組分。但量效關系并不為函數關系（完全相關），其影響因素很多，一方面可能由于旋覆花中抗腫瘤有效組分種類復雜，黃酮類成分只是其中一部分，同時藥材中也存在抑制其發揮藥效的成分；另一方面，黃酮類成分是一類有效組分，不同單體對藥效貢獻的大小不盡相同。當干膏中總黃酮的含有量升高時，發揮藥效與不起作用的單體成分含有量的變化不一致，因此總黃酮的含有量與藥效的量效關系并不呈完全相關。

以藥效指標為導向的藥材提取工藝研究雖能從根本上保證其藥理藥效，但本實驗以綜合評價指標代替藥效，使得相關研究有了新的思路。對旋覆花抗腫瘤有效組分的提取工藝進行研究可為該植物的開發和利用奠定物質基礎，為臨床抗腫瘤新藥的研制提供理論依據，同時也為工業生產和中藥及其復方提取工藝的合理優選提供參考和借鑒。

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*通信作者:孟憲生（1964—），男，博士，教授，博士生導師，研究方向為中藥組分配伍、代謝組學及藥品質量分析。Te1:（0411）85890185，E-mai1: mxsvvv@126.com

作者簡介:黃一凡（1990—），女，碩士，研究方向為藥物分析。Te1:（0411）85890185，E-mai1: 383539919@qq.com

基金項目:“十二五”“重大新藥創制”科技重大專項（2013ZX09507005）

收稿日期:2014-12-19

中圖分類號:R284.2

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0450-04