交聯型“納米花”酶用于擬除蟲菊酯農藥的高效水解研究

劉 宇，葉 泰，曹 慧，袁 敏，于勁松，徐 斐，朱佳怡，祁 泓，陳佳宇

（上海食品快速檢測工程技術研究中心，上海理工大學 健康科學與工程學院，上海 200093）

擬除蟲菊酯是一類常用的殺蟲劑，其結構類似于在菊花中發現的天然除蟲菊酯，但具有更高的殺蟲效力和環境穩定性［1］。擬除蟲菊酯農藥含有酯鍵，可以通過裂解、水解和不可逆抑制等方式破壞酯鍵進行降解［2］。有報道稱羧酸酯酶能夠水解擬除蟲菊酯類農藥［3］，酯酶的催化機制取決于特定的催化三聯體，該三聯體由酯酶活性位點內的3 個氨基酸殘基（絲氨酸、組氨酸和谷氨酰胺或天冬氨酸）組成［4］。然而，高溫、極端pH 值和有機溶劑等環境均會嚴重影響酶的催化活力和穩定性［5-6］。因此，通過酶的固定化策略提高游離酶的表觀活力及環境耐受性受到越來越多的關注［7］。但通過共價結合、吸附、包埋和交聯等方法制備得到的固定化酶［8］存在固定方法繁瑣、催化反應過程傳質速率較差，以及由于固定過程中酶活性位點被封閉或酶構象發生變化而導致其活性喪失等缺點［9-10］。因此，迫切需要開發具有高催化活性和環境耐受性的酶固定化策略。

近年來，通過金屬離子磷酸鹽與蛋白質間的自組裝作用形成的有機-無機雜化納米花材料被廣泛用于固定化酶的制備［11-12］。與傳統制備方式相比，該方法制備條件溫和，且雜化“納米花”材料固有的大比表面積可有效降低傳質阻力，制備得到的“納米花”酶具有較好的酶活和化學穩定性［13-14］。前期工作中，本小組采用生物礦化策略制備了鈣離子豬肝酯酶雜化“納米花”酶（Ca3（PO4）2-PLE），并將其用于擬除蟲菊酯農藥的水解實驗［15］，但酶活僅為游離酶的169%，且制備的納米花酶循環使用6次后，殘余酶活僅為初始值的10%。有研究表明，多級層狀結構自身的柔性會導致制備得到的蛋白-金屬雜化納米花酶在離心純化過程中易被破壞，造成酶活力降低［16-17］。因此，進一步提高納米花酶的機械強度有利于改善其貯存穩定性以及可重復利用性［18-19］。

本文在生物礦化策略的基礎上，引入戊二醛作為交聯劑，制備了交聯型豬肝酯酶雜化“納米花”酶（CL-PLE-NFs）。通過戊二醛交聯，有效改善了納米花酶的儲藏穩定性、有機試劑耐受性以及可重復利用性。在優化交聯雜化“納米花”制備條件的基礎上，進一步研究了其催化活性及短時間內對擬除蟲菊酯類農藥的水解性能，為構建基于酶水解法的擬除蟲菊酯類農藥殘留快速檢測方法提供了新的思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Sepax HP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國賽分公司）；Inspect F50掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；JEM-2100高分辨透射電鏡（日本電子株式會社）；JiS5 傅里葉紅外掃描儀（美國Nicolet 公司）；MD200-2 氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）。

豬肝酯酶（PLE）、戊二醛（Sigma-Aldrich 公司）；溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、S-氰戊菊酯、高效氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、聯苯菊酯、氟胺氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯等菊酯類農藥（上海農藥研究所）；磷酸鹽緩沖液（PBS，1X，pH 7.4）；考馬斯亮藍G-250（生物級，生物工程上海股份有限公司）；七水合硫酸鈷（CoSO4·7H2O）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙酸-1-萘酯、固蘭B及其他試劑（上海國藥化學試劑有限公司）。所有試劑均為分析純，實驗用水為雙蒸水。

1.2 CL-PLE-NFs的合成與交聯

在6 mL 含0.25 mg/mL 豬肝脂酶的PBS（1X，pH 7.4）中，加入40 μL、500 mmol/L 的CoSO4·7H2O，反應過夜，然后加入20 μL、50 mmol/L 的戊二醛溶液，反應4 h 后，離心去除上清液，用超純水水洗3次除去雜質，入0.6 mL 磷酸鹽緩沖溶液（5 mmol/L，pH 8.4）混勻，4 ℃下保存備用。

1.3 酶活及包封率的測定

根據文獻方法進行改進［20-21］：將豬肝酯酶和雜化“納米花”以超純水適當稀釋備用，試管中先加入2 mL pH 6.4 的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，再加入0.5 mL 稀釋后的酶液，最后加入50 μL 底物（125 mmol/L的乙酸-1-萘酯丙酮溶液）混合均勻，在30 ℃水浴反應5 min后，加入0.5 mL顯色劑（0.4%固蘭B的1.8%SDS溶液）混合均勻，再于30 ℃水浴反應5 min。以不加底物的反應液作空白，測定595 nm處的吸光度。1 U的定義為每分鐘能水解10-6mol乙酸-1-萘酯的酶量。根據式（1）計算初始總酯酶活力：

其中，D為酶液的稀釋倍數；A595為反應液在595 nm 處的吸光度（OD）；K為對應pH 值條件下乙酸-1-萘酯標準曲線的斜率（10-6mol/OD）；V為酶液總體積（mL）。

利用考馬斯亮藍法［22］對豬肝酯酶雜化“納米花”的實際蛋白質含量進行測定。雜化“納米花”中蛋白質含量與初始加入的豬肝酯酶蛋白質含量之比即為包封率（EY）：

其中，m為雜化納米花中豬肝酯酶的質量（mg）；M為初始加入到溶液中的豬肝酯酶的質量（mg）。

1.4 CL-PLE-NFs的酶促動力學曲線［23］

將2 mL pH 6.4的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液與0.5 mL豬肝酯酶置于10 mL試管中，加入50 μL不同濃度的底物，混勻后30 ℃水浴反應5 min。然后加入0.5 mL顯色劑，再于30 ℃水浴反應5 min。以不加底物的反應液作空白，測定595 nm 處的吸光度。雜化“納米花”的測定方法同上。根據米氏方程（3），計算米氏常數Km（mol/L）和最大反應速度Vmax（mol·s-1·mg-1）。

其中，V為初始反應速度（mol·s-1·mg-1）；［S］為底物濃度（mol/L）。

1.5 擬除蟲菊酯類農藥水解性能的研究

取“1.2”制得的雜化“納米花”溶液于玻璃管中（酶活力為44 742 U），分別加入200 μL、10 μg/mL 的11種菊酯農藥，于45 ℃以800 r/min 振蕩反應5 min進行水解，再用高效液相色譜檢測剩余農藥濃度。高效液相色譜分析：將5 mL乙腈和1 g NaCl加入到上述酶解反應液，于25 ℃下以1 200 r/min振蕩10 min，靜置分層后，取4 mL 上清液40 ℃氮吹至干，然后加入200 μL 乙腈復溶，用高效液相色譜檢測。

液相色譜條件：色譜柱為Sepax HP-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相A 為乙腈，B 為超純水，A 相∶B 相= 78∶22（體積比）；流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為230 nm，柱溫25 ℃。農藥水解率的計算公式如下：

式中，c0、c1分別為水解前、后菊酯類農藥的質量濃度（μg/mL）。

2 結果與討論

2.1 CL-PLE-NFs的制備條件優化

CL-PLE-NFs 的合成過程如圖1 所示。不同的合成條件會對CL-PLE-NFs 的蛋白包封率和酶活力產生不同的影響，這主要與制備過程中酶的穩定性有關［24］。分別對豬肝酯酶的質量濃度以及交聯劑戊二醛的濃度進行優化，并以相對酶活為指標，篩選出最優的制備條件。圖2A 為不同質量濃度PLE 對交聯雜化“納米花”酶活的影響。當加入酶的質量濃度為0.25 mg/mL 時，酶活最高，為游離PLE 的195%，之后隨著酶質量濃度的增加，相對酶活逐漸下降。這可能是因為溶液中Co2+和PLE 的成核位點所能固定的酶量一定，不會隨著酶質量濃度的增加而增加。Wang 等［25］的研究表明，酶的質量濃度會對交聯雜化“納米花”的形態造成影響，當酶質量濃度從0.2 mg/mL 增加至2 mg/mL 時，所形成的固定化酶逐漸從花狀結構變成平行六面體，且酶活隨之降低。因此，選擇豬肝酯酶的質量濃度為0.25 mg/mL。

圖1 CL-PLE-NFs的制備Fig.1 The schematic of CL-PLE-NFs synthesis

如圖2B 所示，隨著戊二醛濃度的增加，酶活呈現上升趨勢，當戊二醛的濃度為0.05 mol/L 時，酶活達到最高值，為游離PLE的224%。隨著戊二醛濃度的進一步增加，酶活有所降低。這可能是因為戊二醛的濃度較低時，所能結合的蛋白質分子較少，表現為較低的酶活。但隨著戊二醛濃度的增加，固定的PLE 越來越多，過多的酶會堵塞載體孔道，使酶的活性位點相互遮蓋，導致酶活性降低。因此，選擇0.05 mol/L作為戊二醛的最適濃度。

圖2 豬肝酯酶質量濃度（A）與戊二醛濃度（B）對CL-PLE-NFs酶活力的影響Fig.2 Effects of porcine liver esterase mass concentration（A）and glutaraldehyde concentration（B）on the enzyme activity of CL-PLE-NFs

2.2 CL-PLE-NFs的紅外光譜

為了證明游離PLE 已經成功負載，對CL-PLENFs 和游離PLE 進行紅外光譜（FT-IR）分析。結果如圖3 所示，575 cm-1和614 cm-1處為磷酸基團的面內彎曲振動；992 cm-1和1 078 cm-1處是P—O 和P===== O 的不對稱伸縮振動，表明存在磷酸基團；從圖中還可以發現1 620 cm-1和1 655 cm-1處存在明顯的N—H 彎曲振動，表明雜化“納米花”中存在氨基，證明了蛋白質的存在。這些結果均說明CL-PLE-NFs成功制備。

圖3 PLE和CL-PLE-NFs的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PLE and CL-PLE-NFs

2.3 CL-PLE-NFs的酶活力與動力學研究

在最優的制備條件下，對游離PLE 和CL-PLENFs 的酶活進行測定和計算，得到游離PLE 的酶活為5 712 U/mg；CL-PLE-NFs 的酶活為13 232 U/mg，包封率為45.18%。與游離酶相比，CL-PLE-NFs 的酶活提高了231%。說明Co2+和組氨酸的配位結合選擇性地驅動了礦化和戊二醛的交聯作用，有助于“納米花”的合成，并可以提高酶活力。進一步評估了CL-PLENFs 的催化活性，通過測定不同底物濃度下PLE 和CL-PLE-NFs 的酶活，對初始反應速率進行非線性曲線擬合，計算PLE 和CL-PLE-NFs 的動力學參數Km和Vmax。從圖4可以看出，CL-PLE-NFs的Km值約為游離PLE的150%，可能是因為交聯劑戊二醛的加入增加了傳質阻力，造成納米花酶與底物的親和力降低。另外，由圖4 插圖可知，CL-PLE-NFs 的Vmax為游離酶的134%，可能是因為納米花的比表面積大，增加了底物與活性位點碰撞的可能性。

圖4 PLE和CL-PLE-NFs的米氏曲線Fig.4 Michaelis curves of PLE and CL-PLE-NFs

2.4 CL-PLE-NFs的穩定性分析

對CL-PLE-NFs 的pH 值（5.0 ～9.0）穩定性和溫度（20 ～60 ℃）穩定性進行測定。圖5A 為游離PLE和CL-PLE-NFs的pH值穩定性結果，可以發現在不同pH值下放置30 min之后，兩種酶均可以保留64%以上的酶活，而且pH 值越高，酶活損失越少，說明堿性環境有利于酶的水解作用。除此之外，還發現CL-PLE-NFs在不同pH值條件下殘余的酶活力均高于游離PLE，具有更好的pH值穩定性。從圖5B可以看出，CL-PLE-NFs在40 ℃之前比較穩定，50 ℃時仍保留有65%的活性，而游離PLE 在大于30 ℃之后迅速失活。結果說明CL-PLE-NFs 具有良好的溫度穩定性，這可能是因為CL-PLENFs的片層狀花瓣結構對PLE具有保護作用，可以使其在實際應用中使用的溫度范圍更廣。

圖5 pH值（A）、溫度（B）對PLE和CL-PLE-NFs相對酶活的影響，以及4 ℃（C）、25 ℃（D）時PLE和CL-PLE-NFs的儲藏穩定性Fig.5 The effects of pH value（A）and temperature（B）on the relative activity of PLE and CL-PLE-NFs，and the storage stability of PLE and CL-PLE-NFs at 4 ℃（C）and 25 ℃（D）

從圖5C可以發現，CL-PLE-NFs在4 ℃下儲藏320 d仍能保留70.85%的活性，而游離PLE 的酶活呈現逐漸下降的趨勢，在20 d 之后，酶活已經不足80%，當儲藏時間到達92 d 時，游離PLE 的酶活損失一半。圖5D 也呈現類似的現象，CL-PLE-NFs 在25 ℃條件下儲藏171 d 后依然能夠保留59%以上的活性，且其穩定性遠高于游離PLE。游離PLE 的酶活在儲藏7 d后即開始急速下降；經過31 d后，酶活已不足20%；隨著時間的進一步延長，當儲藏時間達到92 d 時，游離PLE的酶活只有初始酶活的5%。表明經過交聯雜化的PLE 的儲藏穩定性遠優于游離PLE。

2.5 CL-PLE-NFs的有機試劑耐受性

考察了CL-PLE-NFs對15%的甲醇、乙腈、乙醇、丙酮的耐受性。結果如圖6所示，在分別含有上述4種常用有機試劑的環境中，CL-PLE-NFs的相對酶活分別為游離酶的4.5、1.75、2.4和5倍，表明CL-PLE-NFs對于有機試劑有著更好的耐受性。

圖6 4種有機試劑對PLE和CL-PLE-NFs酶活力的影響Fig.6 The effects of four kinds of organic solvent on the activity of PLE and CL-PLE-NFs

2.6 CL-PLE-NFs對不同擬除蟲菊酯類農藥水解性能的研究

CL-PLE-NFs 在5 min 內對11 種擬除蟲菊酯類農藥的水解結果如圖7 所示，其對Ⅰ型和Ⅱ型菊酯類農藥的水解率均在55%以上，說明合成的CL-PLE-NFs 對菊酯類農藥具有良好的水解性能。對于不同的擬除蟲菊酯類農藥，CL-PLE-NFs 的水解效率不同。這可能是因為農藥分子的精細結構存在差異。對于Ⅱ型菊酯類農藥，氯氰菊酯的水解效果最好，水解率達93.91%；對Ⅰ型菊酯類農藥聯苯菊酯的水解率達到了62.12%。

圖7 CL-PLE-NFs對不同擬除蟲菊酯類農藥的水解率Fig.7 Hydrolysis rates of different pyrethroids by CL-PLE-NFs

2.7 CL-PLE-NFs的可重復利用性

為了驗證CL-PLE-NFs 的可重復利用性，選取溴氰菊酯為對象進行循環水解實驗，考察了不同重復利用次數條件下，CL-PLE-NFs對溴氰菊酯的水解性能。結果如圖8 所示，CL-PLE-NFs 在循環使用8 次后仍保持80.52%的水解效率。隨著循環次數的增加，CL-PLENFs 對于溴氰菊酯的水解率逐漸降低。經過12 次循環反應后，CL-PLE-NFs 對溴氰菊酯仍保持65.37%的水解率。以上結果表明，交聯型雜化納米花酶具有優異的重復利用性。

圖8 CL-PLE-NFs在擬除蟲菊酯農藥水解實驗過程中的可重復利用性Fig.8 Reusability of CL-PLE-NFs in pyrethroid pesticide hydrolysis experiment

3 結 論

本文制備了CL-PLE-NFs，其表觀酶活為游離酶的231%，在4 ℃條件下貯藏320 d 后，仍能保留70.85%的酶活力；此外，該酶對Ⅰ型和Ⅱ型的菊酯類農藥均有較好的水解能力，在5 min 內對11 種擬除蟲菊酯農藥的水解率均達55%以上。且循環使用12 次后，對溴氰菊酯農藥的水解效率仍達65.37%。CLPLE-NFs有望用于酶法擬除蟲菊酯農藥快速檢測試劑盒的開發與應用。