生物安全實驗室病毒懸液滅活試驗方法標準轉化研究

鄧阿妹， 魏　鳳，吳　佳，馬海霞，袁志明

(1. 中國科學院武漢文獻情報中心，武漢　430071； 2. 中國科學院武漢病毒研究所，武漢　430071)

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生物安全實驗室病毒懸液滅活試驗方法標準轉化研究

鄧阿妹1， 魏鳳1，吳佳2，馬海霞2，袁志明2

(1. 中國科學院武漢文獻情報中心，武漢430071； 2. 中國科學院武漢病毒研究所，武漢430071)

【摘要】化學消毒劑常用于病毒的滅活和實驗室環境的消毒，其對病毒滅活的效果及評價直接影響實驗室的生物安全。鑒于目前我國尚缺乏對化學消毒劑殺病毒效果的評價標準，本文在對歐盟現行的化學消毒劑殺病毒定量懸浮試驗標準的研究分析的基礎上，結合我國生物安全實驗室的管理現狀，提出了歐盟現行標準轉化的方案。建議以包括高致病性病毒的替代病毒在內的6種病毒作為試驗用的模式病毒，同時增加殘留化學消毒劑的去除方法和試驗結果95%置信區間計算方法內容。該建議提高了標準的科學性和可操作性，并為我國實驗室消毒滅菌標準制定提供了參考。

【關鍵詞】病毒滅活；化學消毒劑；生物安全；標準；定量懸浮試驗；殺病毒效果評估

生物安全實驗室活動涉及對包括病毒在內的多種高致病性病原微生物的操作和研究。采取消毒措施對被病毒污染的環境、儀器設備、實驗廢棄物及人體表面的消毒是避免實驗室工作人員感染和病毒向實驗室外環境泄露的重要手段。消毒方法不當極易造成人員的感染和病毒的傳播，從而導致極其嚴重的生物安全事故。2004年北京發生了實驗室SARS冠狀病毒感染事件。事后查明，是由于采用未經論證和效果驗證的非典病毒滅活方法，在不符合防護要求的普通實驗室內操作冠狀病毒感染材料造成的[1]。因此，做好消毒工作對于生物安全實驗室的正常運行和人員的生命安全具有非常重要的意義。

利用化學消毒劑對病毒污染物進行消毒需要對病毒滅活的效果進行正確、科學的評價。目前，國際上主要采用病毒懸液滅活試驗法和病毒載體滅活試驗法在實驗室條件下對化學消毒劑的殺病毒活性進行檢測和評估，其中病毒懸液滅活試驗法因操作相對容易而成為最常使用的方法[2-4]。病毒懸液滅活試驗法是在實驗室中模擬實際使用條件對化學消毒劑殺病毒懸液的活性進行測試和驗證，其結果可作為實際生活中選擇化學消毒劑和評估殺病毒效果的主要參考依據。一些國家已將該方法作為標準推出以規范對該方法的使用，如歐盟標準NF EN 14476 “化學消毒劑和防腐劑 —人類醫學中化學消毒劑和防腐劑的殺病毒定量懸浮試驗 — 試驗方法和要求”就是一個在歐盟被廣泛使用、同時也被國際社會接受的標準。隨著科學技術的進步和研究的深入，人們對于病毒性質和傳播機制的了解逐步加深，這為病毒懸液滅活試驗方法標準的改進和優化提供了有利條件。

基于中法生物安全標準化領域的研究與合作，本研究針對化學消毒劑殺病毒定量懸浮試驗這一方法標準開展相關分析和研究，希望通過調研和追蹤該方法的最新研究進展發現標準存在的不足，并提出改進建議，為我國制定殺毒滅菌相關標準提供參考。

1研究目標和方法

本研究的研究目標有3點：(1)對法國歐盟標準NF EN 14476 “化學消毒劑和防腐劑 — 人類醫學中化學消毒劑和防腐劑的殺病毒定量懸浮試驗 — 試驗方法和要求(第2階段第1步)”[5]的內容進行深入分析。該標準由歐盟委員會于2005年發布并被法國轉化為國家標準。在內容上，該標準包括了“范圍”、“規范性引用標準”、“術語和定義”、“試驗要求”、“材料和試劑”、“試驗方法”、“用于指定病毒的試驗程序”、“試驗數據的計算”、“試驗結果的表示”和“附錄”等10個部分。通過對標準內容的深度分析，全面掌握標準涉及的關鍵信息；(2)通過檢索分析的方法，利用Web of Science 數據庫對相關論文進行檢索。Web of Science 數據庫收錄了從1970年至今的8000多種世界范圍內最具有影響力的、經同行專家評審的高質量的期刊。本研究利用“disinfectant”、“virus inactivation”、 “virucidal activity”、“quantitative suspension test”等關鍵詞對該數據庫中2005至2015年10年間全球發表的消毒滅菌相關論文進行檢索。通過文獻調研的方法對檢索到的科技文獻加以深度分析和研究，聯合專家咨詢的方法以期詳細掌握化學消毒劑殺病毒懸液試驗方法的研究進展。(3)掌握化學消毒劑殺病毒定量懸浮試驗方法標準在相關國家的應用狀況。

通過以上3個目標的研究和分析，將掌握的該領域的研究進展與法國歐盟標準NF EN 14476開展比對分析，結合對標準實際應用情況的調研，對標準的內容給出改進和完善的建議。

2標準NF EN 14476內容解析

標準NF EN 14476規定了化學消毒劑殺病毒定量懸浮試驗的方法和最低要求，篇幅較長、內容較多、信息量大。需對內容的關鍵信息進行總結和提煉，以便于同文獻中的相關信息進行比對分析。現將該標準內容的關鍵信息及特點進行總結，如表1。

標準NF EN 14476從制定到現在已過去10多年，上述表中涉及的一些技術和方法是當時科學研究所取得的成果，代表著當時科學技術的水平，該標準的提出和制定也是根據當時的科學研究的狀況和實際的需求。隨著時代的發展和科技的進步，該標準涉及的方法和技術是否落后？該標準是否還適用于當今的科學研究？是否能滿足當今實際工作的需要？這些都是必須思考的問題。

3標準NF EN 14476的分析和優化

根據對文獻信息的深度挖掘和分析，化學消毒劑殺病毒懸液試驗方法在試驗模式病毒的種類、試驗病毒的替代病毒、殘留化學消毒劑的去除方法、對照和對比試驗的設置及試驗結果的計算和分析等方面均取得了新的研究進展和成效。針對標準NF EN 14476，可以在這些方面對其進行優化，下面展開具體論述。

表1　法國歐盟標準NF EN 14476內容關鍵信息總結

注：N0：未經消毒劑處理的陽性病毒對照的滴度值； Nx：消毒劑處理的病毒滴度值

表2　法國歐盟標準NF EN 14476試驗模式病毒優化前后對比

3.1試驗模式病毒的種類分析

在實驗室環境下進行化學消毒劑殺病毒定量懸浮試驗時，設定試驗的模式病毒非常必要。由于病毒種類繁多、性質各異，任何實驗室都無法達到條件來測試所有消毒劑對全部已知病毒的殺滅活性，因此需采用模式病毒進行試驗。試驗模式病毒需具備安全性高、穩定性高、可操作性強、易增殖等特點。目前，世界上對于模式病毒沒有統一的規定，各國都在積極尋找各種核酸類型的病毒作為試驗的模式病毒。

標準NF EN 14476規定的試驗模式病毒有3種，分別是作為無包膜RNA病毒類代表的類型1脊髓灰質炎病毒(毒株為LSc-2ab)、作為無包膜DNA病毒類代表的類型5腺病毒(毒株為adenoid 75和ATCC VR-5)和作為耐熱病毒類代表的牛細小病毒(毒株為Haden和ATCC VR-767)。根據有無包膜結構，病毒分為包膜病毒和無包膜病毒兩大類。包膜結構對化學消毒劑比較敏感，一般認為，無包膜病毒對化學消毒劑的抵抗力強于包膜病毒，如果化學消毒劑對無包膜病毒具有殺滅活性，那么它對包膜病毒也應具有殺滅活性。但是，由于病毒性質的巨大差異，事實情況卻并非如此，例如，含乙醇或甲醛的消毒劑可將無包膜的脊髓灰質炎病毒滅活，卻不能將包膜病毒SV40滅活。事實上，除了無包膜病毒之外，包膜病毒也可以作為試驗的模式病毒。痘苗病毒(VACV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和猴多瘤病毒40(SV40)擁有模式病毒要求的諸多特點，具備作為模式病毒的潛力。為此，研究者們開展了大量的研究工作，從實踐上證明了這3種包膜病毒作為模式病毒的可行性[6-11]。

標準NF EN 14476僅將無包膜病毒作為試驗的模式病毒，忽視了包膜病毒作為模式病毒的必要性，從這一點來說，該標準不夠科學和嚴謹。因此，應對標準NF EN 14476的試驗模式病毒的種類進行擴充，在已有模式病毒的基礎上將VACV、BVDV和SV40作為評估化學消毒劑對包膜病毒殺滅活性的模式病毒。標準NF EN 14476試驗模式病毒優化前后對比見表2所示。

3.2試驗病毒的替代病毒分析

在實際生活中，存在一些如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、諾如病毒、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)等流行度高、致病性強、危害性大的病毒，給人類的健康造成了極大威脅。實驗室條件下檢驗化學消毒劑對這類高危病毒的殺滅活性時，僅使用模式病毒是不夠的。直接利用這些病毒作為試驗病毒理論上是最科學的，但是，由于這些病毒具有極強的感染性和致病性，而且還存在體外增殖困難的缺點，在實際操作上是不可行的。為了解決這些問題，學者們開展了替代病毒的研究，以期發現或改造一些與這些病毒結構和屬性類似、對人體不致病或致病性較弱且易于體外增殖的病毒來代替高致病性病毒開展試驗。研究者們發現，可用鴨乙型肝炎病毒(DHBV)代替HBV[12]、用BVDV代替HCV[13]、用鼠諾如病毒(MNV)或貓杯狀病毒(FCV)代替人諾如病毒[14,15]、用牛冠狀病毒(BCV)或禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)代替SARS-CoV[16]開展化學消毒劑對以上高危病毒殺滅活性的試驗。另外，雖然要求試驗模式病毒對人體應具有安全性，但實際上，一些模式病毒仍可以使人體致病，尋找更加安全的模式病毒替代它們也是研究者們關心的問題[17]。改良安卡拉痘苗病毒(MVA)是痘苗病毒經過人工改造后的變異體，喪失了對人體的感染能力。有研究表明，改良安卡拉痘苗病毒可以作為痘苗病毒理想的替代物[18]。目前，研究者們還沒有尋找到合適的病毒來替代脊灰病毒作為模式病毒，這將是未來研究工作需要解決的問題。標準NF EN 14476沒有涉及試驗病毒的替代病毒，有必要依據以上研究結果對其進行補充和完善。以上病毒及替代病毒總結如表3。

表3　化學消毒劑殺病毒活性的試驗病毒與替代病毒

3.3殘留化學消毒劑的去除分析

試驗過程中殘留的化學消毒劑會使細胞培養物中毒，導致試驗結果的可靠性降低，因此有必要將其去除。標準NF EN 14476中，對毒性較低的化學消毒劑采用稀釋法將其去除，對毒性較高且稀釋法無法取得理想效果的化學消毒劑，采用SephadexTMLH-20凝膠過濾技術將其去除。標準NF EN 14476涉及的這兩種方法在實際應用上都存在缺陷。由于化學消毒劑種類繁多、性質復雜，對毒性較低的化學消毒劑僅采用稀釋法往往達不到預期的去除效果，且稀釋過程還會延長化學消毒劑和病毒的接觸時間。另外，利用SephadexTMLH-20凝膠去除毒性較高的化學消毒劑也存在以下兩點弊端：(1)去除過程耗時長，至少需要2 min甚至更長時間，這明顯延長了病毒與化學消毒劑的接觸時間；(2)適用化學消毒劑的范圍較小，僅適用于少數的化學消毒劑，對大部分的化學消毒劑都不適用。鑒于以上問題，有學者建議采用中和稀釋法去除低毒性的化學消毒劑，即先用中和劑中和，再用稀釋法進行連續稀釋，即可實現殘留化學消毒劑的有效去除[19]。此外，法國學者介紹了兩種新型凝膠SephadexTMG-10和SephadexTMG-25在去除高毒性化學消毒劑上的應用，這兩種凝膠相比SephadexTMLH-20凝膠具有明顯優勢，不僅適用于絕大多數的化學消毒劑，而且去除過程僅需1 min，另外，使用成本也較低[20]。

標準NF EN 14476在殘留化學消毒劑去除上僅涉及兩種物理方法，且這兩種方法在使用上均存在缺陷。因此，應對標準NF EN 14476的該部分內容進行補充和完善，在兼顧物理方法和化學方法的同時，還應考慮兩種新型凝膠SephadexTMG-10和SephadexTMG-25的應用。

3.4對照和對比實驗的設置分析

為了試驗結果的可靠性和真實性，也為了便于對意外結果的分析，在試驗過程中需設置多組對照和對比試驗。就化學消毒劑殺病毒定量懸浮試驗來說，需設置的對照實驗包括評估化學消毒劑殺病毒活性的病毒對照實驗、評估干擾物對病毒感染性影響的實驗、評估干擾物對細胞影響的實驗、評估化學消毒劑對細胞毒性的實驗、評估稀釋過程對病毒感染性影響的實驗及甲醛對照實驗。標準NF EN 14476雖在部分章節零星地提到了對照實驗的設置，但缺少對這些對照進行系統性的歸納，且描述也不夠詳盡和全面，使標準的使用者對需要設置哪些對照實驗及如何設置沒有一個很清晰的理解。因此，應考慮在標準NF EN 14476 內容上設立一個單獨章節，對所需的對照實驗進行系統條理的歸納和總結，并對設置方法做詳細的說明，使標準的使用者能夠快速準確地理解并掌握對照實驗的設置方法。

3.5試驗結果的計算分析

標準NF EN 14476要求，對試驗結果進行計算時，只需計算出未經化學消毒劑處理的病毒陽性對照的滴度對數值(logN0)和反應混合物在各接觸時間點的病毒滴度的對數值(logNx)，根據兩者的差值(logN0- logNx)對結果進行分析和判斷。如果該差值不低于4說明試驗化學消毒劑對試驗病毒具有殺滅活性，該化學消毒劑實驗室試驗合格；反之則說明試驗化學消毒劑對試驗病毒不具有殺滅活性，該化學消毒劑實驗室試驗不合格。但是，由于每次試驗存在隨機誤差，僅計算病毒滴度的對數值是不夠的。研究者越來越傾向于對實驗結果置信區間的計算[21]?；谥眯艆^間的結果分析能夠真正地反映化學消毒劑實際殺病毒活性的不確定度，使試驗結果更加科學、嚴謹、可信。標準NF EN 14476對試驗結果的計算要求較簡單，不夠科學嚴謹。因此，對標準NF EN 14476該部分內容進行補充和完善時，應要求每次試驗不僅需計算出病毒的滴度值，還需對結果進行95 %置信區間的計算。

4對我國相關生物安全工作的啟示與建議

根據以上研究，針對我國相關的生物安全工作，給出以下建議：(1)重視生物安全實驗室消毒滅菌技術方法標準和消毒滅菌效果評價方法標準的制訂，完善生物安全實驗室消毒滅菌方法及評價體系。不僅需要制定針對不同危險等級病毒的多種消毒滅菌方法，還需考慮空氣、管道、儀器設備、防護服等被病毒污染的介質的消毒滅菌的特殊要求。建立健全消毒滅菌效果評價方法體系，指導化學消毒劑科學、合理、安全的使用，規范消毒滅菌方法的正確實施。此外，應加強對實驗室工作人員消毒滅菌方法技術的培訓和指導，增強工作人員的安全防范意識，提高個人的安全防護知識水平和突發事故處理技能。管理者應不斷完善實驗室生物安全防范措施，強化生物安全管理能力，提高生物安全管理水平。(2)加強頂層設計，統籌規劃和協調，重視建立生物安全技術的研發體系，提高我國生物安全技術的研發水平和生物安全產品的國際競爭力。首先應加強生物安全領域的基礎研究，包括病毒基本性質和傳播致病機制的研究、環境風險的起因和性質研究、風險評估和風險管理的技術研究、實驗室安全操作的技術研究、病原微生物專用檢測技術及專用檢測設備的研究等。此外，還應重視對高等級生物安全技術的研究，包括高致病性病原體隔離與防護技術的研究，比如結構氣密性、風量控制、差壓控制等技術的研究；化學淋浴消毒和連續消毒等新型消毒方法及消毒效果評價的技術研究；正壓防護服、呼吸防護裝置等高等級生物防護裝備系統的研究等。(3)加強生物安全的國際合作與交流，了解世界生物安全的發展動態和趨勢，吸取國際生物安全事故的慘痛教訓，吸收和引進國際先進的生物安全技術和方法。學習和借鑒國外在管理、監測、評估等方面的成功經驗，提升我國的生物安全管理能力。加強對外宣傳，樹立我國生物安全管理的良好形象，保障我國生物技術從研究開發到生產應用對外合作的廣泛開展。根據生物安全技術發展的特點和趨勢，結合我國國情，規劃我國生物安全的發展戰略、優先行動和重點項目，以完善我國的生物安全體系和提升我國生物安全的國際化水平。

5總結

本研究針對法國歐盟標準NF EN 14476內容的改進和完善開展了分析和研究工作，根據研究結果，對標準的內容給出以下幾點優化建議：

(1)原標準中試驗模式病毒的種類可由3種(脊灰病毒、腺病毒和牛細小病毒)增加至6種(脊灰病毒、腺病毒、痘苗病毒、牛病毒性腹瀉病毒、猴多瘤病毒和細小病毒)，以滿足病毒對化學消毒劑抵抗力多樣性的試驗需求；

(2)在原標準的基礎上，可增加實驗危險病毒的替代病毒選項，增加試驗方法的靈活性、適應性、實用性和安全性；

(3)原標準提到的殘留化學消毒劑去除方法已經不太適用于當前復雜多變的病毒環境和日益增多的各式化學消毒劑制品，建議在原標準單純物理稀釋法的基礎上增加化學中和方法，并考慮兩種方法的融合交叉使用。此外，建議使用兩種新型凝膠技術SephadexTMG-10和SephadexTMG-25對殘留的高毒性化學消毒劑進行去除；

(4)在原標準的基礎上可增加全面且詳細的對照和對比實驗信息，如評估化學消毒劑殺病毒活性的對照實驗、評估干擾物對病毒感染性影響的對照實驗、評估干擾物對細胞影響的對照實驗、評估化學消毒劑對細胞毒性的對照實驗、評估稀釋過程對病毒影響的對照實驗及證明試驗病毒適用性的甲醛對照實驗，以增強試驗體系的科學性和嚴謹性；

(5)在試驗結果的計算和分析方面，建議在原標準方法的基礎上增加對試驗數據的95 %置信區間的計算，以提高結果分析的準確性和科學性。

上述的分析研究結果將為我國制定符合國家發展狀況、先進的消毒滅菌方法標準提供借鑒和參考，以促進我國的生物安全標準化水平，幫助我國生物安全技術和管理水平的進一步提高。因此，我國不僅要加強生物安全相關技術的研發和應用布局，也應及時對現有標準進行內容更新和完善，將最新的研究成果加以應用和推廣，滿足我國當前生物安全技術的需求。

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〔修回日期〕2015-12-24

Transformation and standardization of the inactivation test method for virus suspension in biosafety laboratory

DENG A-mei1, WEI Feng1, WU Jia2, MA Hai-xia2, YUAN Zhi-ming2

(1. Wuhan Library, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China;2. Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)

【Abstract】Chemical disinfectants are generally used for virus inactivation and environment disinfection in biosafety laboratory, and the efficacy and evaluation of the disinfection are critical to ensure the laboratory biosafety. However, there is a current lack of applied standard to evaluate the virucidal efficacy of chemical disinfectants in our country. In this paper, a European Union standard “Method and Requirements of Virucidal Quantitative Suspension Test Method for Chemical Disinfectants Used in Human Medicine” was analyzed and a standard transformation scheme has been proposed. It is suggested that the model viruses should be increased from 3 to 6, including the surrogate viruses to substitute highly pathogenic viruses, and that the method to remove the residual chemical disinfectant and the calculation of 95% confidence interval should be incorporated into the standard. The suggestion will improve the scientific and operational standards related to disinfection and sterilization in biosafety laboratory in China.

【Key words】Virus inactivation; Chemical disinfectant; Biosafety; Standard; Quantitative suspension test; Virucidal effect evaluation

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.006

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 02-0027-06

[作者簡介]鄧阿妹(1981-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向：標準情報的研究與分析。 E-mail: dengam@mail.whlib.ac.cn。[通訊作者]袁志明，E-mail: yzm@pentium.whiov.ac.cn。

[基金項目]“十二五”國家衛生行業專項項目(2012ZX10004403)；國家自然科學基金項目(71103178)；中國科學院優秀人才擇優支持項目；武漢市科技項目“武漢市新發傳染病與生物安全重點實驗室”(201261638501)。

“實驗動物國家標準論壇”專題