犬副流感病毒的分離鑒定及部分基因序列分析

孫　明，劉巧榮，秦亞嫚，鄧小雨，楊欣艷，劉伯華，陳西釗,2

(1. 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京　100085；2.中國動物疫病預防控制中心，北京　100125)

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研究報告

犬副流感病毒的分離鑒定及部分基因序列分析

孫明1，劉巧榮1，秦亞嫚1，鄧小雨1，楊欣艷1，劉伯華1，陳西釗1,2

(1. 北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京100085；2.中國動物疫病預防控制中心，北京100125)

【摘要】目的分離并鑒定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV)，并對該病毒N、HN和F基因進行序列分析，研究其遺傳變異情況；為CPIV診斷、治療以及預防奠定分子生物學基礎。方法用Vero細胞接種感染CPIV陽性犬肺組織，盲傳3代，觀察病變情況，收集72 h培養(yǎng)液進行PCR鑒定、血凝特性以及形態(tài)學觀察。同時，用3對特異性引物，擴增N、HN和F全基因，進行序列測定和分析，并制作系統(tǒng)進化樹。結果從犬肺中成功分離出一株犬副流感病毒，并命名為QF20100726。該病毒能凝集豚鼠、豬、雞和人O型血，電鏡觀察病毒呈圓形、長絲狀等形態(tài)多樣、大小不等的顆粒狀；序列分析表明，與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒基因相比，N基因核苷酸同源性為 95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%，其中有兩處氨基酸發(fā)生新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T；HN基因核苷酸同源性為95.5～99.8%，氨基酸同源性為96.3～99.6%，F基因核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為 95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成了S，89位由T變成了M。結論成功分離犬副流感病毒QF20100726分離株，其血凝特性及超微形態(tài)特征均符合CPIV特性，N、HN和F全基因生物進化樹顯示，該分離株與犬副流感病毒分離株08-1990(登錄號：KC237063)親緣關系最近；N基因氨基酸在第257位(由V變成了A)和第301位(由A變成了T)，F基因氨基酸在第56位(由T變成了S)和89位(由T變成了M)發(fā)生了特異性變異。這些數據將為CPIV的防控奠定基礎。

【關鍵詞】CPIV；病毒分離；序列分析

犬副流感病毒感染(canine parainfluenza virus infection)是由犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV)引起的犬的一種接觸性傳染病，主要表現為發(fā)熱、流涕和咳嗽。CPIV是犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病(即“犬窩咳”)的主要病源之一[1]。常引起犬的支氣管炎和支氣管肺炎，損害呼吸道上皮細胞，給其他病原體的感染創(chuàng)造了條件[2,3]。1967年Binn等用犬腎細胞首次從患有呼吸道病的犬體內分離到犬副流感病毒，此后在世界各地均有CPIV的報道，嚴重影響著世界各國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展。

CPIV是單股、不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，約為15246 bp[4]。CPIV基因組主要編碼6種蛋白：大蛋白(L)、血凝素神經氨酸酶(HN)、核衣殼蛋白(NP)、融合蛋白(F)、磷蛋白(P)和基質蛋白(M)，其中NP蛋白是核衣殼蛋白的主要成分，與病毒RNA直接結合，高度保守，在病毒感染時可引起強烈的抗體反應，HN蛋白和F蛋白突出于囊膜形成纖突，分別介導病毒吸附和穿入細胞。

該病毒在分類上屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)茹布拉病毒屬(Rubulavirus)。與同屬的猴病毒V型(SV5)、人SV5分離株及人副流感病毒- II 型(hPIV-II)抗原性密切相關[5]。目前，市場雖有此類疫苗，該病仍然時有發(fā)生，可能與該病毒的不斷變異有關，故分離當前的流行變異株，了解序列變異情況對于預防該病的流行、診斷和治療等具有重要意義。

1材料和方法

1.1病料

臨床診斷犬副流感病毒病死京巴犬，年齡約1歲。臨床表現為患犬精神萎頓、不喜食；咳嗽、流涕、喘息等呼吸道癥狀，伴有發(fā)燒。治療無效死亡，取肺臟進行處理。

1.2細胞系

Vero細胞為本實驗室保存。

1.3載體、菌株、試劑

pGEM-T-easy購自Promega公司。DH5a感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。氨芐青霉素、購自Sigma公司。病毒RNA提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自Omega公司。DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清為Gibco產品。

1.4病毒分離

參照白文彬等介紹的方法[6]，進行病毒分離，并將病毒命名為QF20100726。

1.5病毒鑒定

1.5.1血凝試驗：參考姚火春介紹的方法[7]，分別采集豚鼠、雞、豬抗凝血，用PBS (pH 7.4)洗滌紅細胞四次，1 500 rpm離心10 min，用PBS(pH 7.2)配成1%紅細胞懸液進行血凝試驗(HA)。

1.5.2RT-PCR鑒定：用引物對：5′-AGTCAGAGTAGTTCAATAAGGACCTATC-3‘和5’-TGGTGAATTGAGATGGACTTCAGG-3′對所分離的病毒進行RT-PCR鑒定，擴增程序：42℃ 45 min，95℃ 3 min，95℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.5.3病毒的電鏡觀察：參考殷震、金昌德等介紹的方法[3,8]，對細胞培養(yǎng)液負染色，進行電鏡觀察。

1.6N、HN和F基因的克隆測序

1.6.1引物設計與合成：依據GenB上的CPIV基因組序列，分別針對N基因、HN基因和F基因設計了引物。如下：

N1：5′-AGTCAGAGTAGTTCAATAAGGACCTATC-3′

N2：5′-TGGTGAATTGAGATGGACTTCAGG-3′

HN1：5′-TTGCTGTCCTAACACCTGCTATAG-3′

HN2：5′-TGGTGAATTGAGATGGACTTCAGG-3′

F1：5′-CCAATAACTGGAATCACCAGCTTG-3′

F2：5′-CGAGACGGTTCTTTCAATACTAGTTTC-3′

三對引物分別可擴增大小為1 678 bp、1 964 bp、和1 830 bp的片段。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.6.2擴增及克?。?/p>

1.6.2.1病毒RNA的提取： 參照Omega公司的病毒RNA提取試劑盒操作說明提取PRV總DNA。

1.6.2.2RT-PCR擴增： 42℃ 45 min，95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.6.2.3PCR產物電泳、克隆和序列測定：PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Omega 公司膠回收試劑盒回收PCR產物，克隆到pGEM-T-easy，經PCR鑒定陽性的重組質粒送上海英駿生物技術有限公司測序。

2結果

2.1病毒分離培養(yǎng)

病料接種到Vero細胞第5代24 h后出現典型細胞病變，至第5 天收毒時，大部分細胞融合，裂解死亡，培養(yǎng)液中碎片增多，相同條件下的正常細胞無此變化(圖1和圖2)。

2.2血凝試驗

病毒在25℃條件能凝集豚鼠、豬、雞和人O型紅細胞。

2.3RT-PCR鑒定結果

對Vero細胞培養(yǎng)病毒進行犬副流感病毒的RT-PCR檢測，結果顯示， Vero細胞培養(yǎng)的病毒為CPIV陽性。

2.4電鏡觀察

電鏡照片顯示，CPIV為圓形，有囊膜，直徑80 nm左右，囊膜上有直徑8 nm～10 nm的纖突。病毒因囊膜的破損而形態(tài)不規(guī)則，呈多形性、長絲狀等長絲狀核衣殼見圖3。

2.5N、HN和F基因克隆、測序

用設計的N、F和HN基因引物擴增的產物經瓊脂糖電泳顯示，分別可見約1 680 bp、1 970 bp、和1 830 bp左右的3個基因片段(圖4)，大小與N、F和HN蛋白基因相符，預測結果證實所克隆的基因正確。

圖1　正常對照vero細胞Fig.1　Normal control vero cells

圖2　CPIV接種vero后24 h細胞變化Fig.2　Vero cells at 24 hours after CPIV inoculation

圖3　電鏡下不同形態(tài)的病毒粒子(標尺=200 nm)Fig.3　Different morphology of the virus particles observed under electron microscope(Bar=200 nm)

1. N基因, 2. F基因, 3. HN基因 M. Marker圖4　N、F和HN基因擴增1. N gene, 2. F gene, 3. HN gene, M. markerFig.4　Amplification of N, F and HN genes

2.6N序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒N基因相比，核苷酸同源性為 95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%。其中有兩處氨基酸發(fā)生新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號：JQ743324)同源性最低為97.4%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號：KC237063)和D277(登錄號：KC237065)同源性最高均為99.6%。用DNAMan生物軟件繪制系統(tǒng)進化樹見圖5。

圖5　N基因系統(tǒng)進化樹Fig.5　The phylogenetic tree based on N gene

2.7F基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒F基因相比。核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為 95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成了S，89位由T變成了M。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號：JQ743324)同源性最低為95.6%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號：KC237063)同源性最高為99.3%。F基因系統(tǒng)進化樹顯示，該分離株與分離株D277和08-1990在一個分支上(圖6)。

圖6　F基因系統(tǒng)進化樹Fig.6　The phylogenetic tree based on F gene

2.6HN基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒H基因相比，核苷酸同源性為95.5～99.8%，氨基酸同源性為96.3～99.6%，其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號：JQ743324)同源性最低為95.5%，與犬源副流感病毒分離株D277(登錄號：KC237065)同源性最高為99.6%。HN基因系統(tǒng)進化樹顯示，該分離株與D277和08-1990分離株在一個分支上(圖7)。

圖7　HN基因系統(tǒng)進化分析Fig.7　The phylogenetic tree based on HN gene

3討論

血清學調查表明，CPIV 在世界各國普遍存在[9-11]，是危害犬業(yè)重要傳染病之一。該病毒廣泛感染玩賞犬、實驗犬、警犬和軍犬。主要表現為發(fā)熱、流涕和咳嗽，在軍犬和警犬中長導致嗅覺障礙。另外CPIV也可引起急性腦脊髓炎和腦內積水，臨床表現為后驅麻痹和運動失調等癥狀，嚴重危害犬類的健康生長。近年來，隨著養(yǎng)犬業(yè)的不斷擴大，犬副流感病毒感染越來越受到人們的重視。北京某動物醫(yī)院診治一例臨床診斷為疑似CPIV感染京巴犬，表現為精神萎頓、不喜食；咳嗽、流涕、喘息等呼吸道癥狀，伴有發(fā)燒，治療無效死亡。自然條件下犬單獨感染CPIV的情況不為多見，究其死亡原因，可能與細菌、支原體和病毒等混合感染有關[12]。為了分析CPIV變異情況，本研究從此患犬肺臟組織中分離得到一株CPIV，命名為QF20100706，并對其部分基因序列進行分析，研究基因變異情況。

該病毒在4℃條件下能凝集豚鼠、豬、雞和人“O”型紅細胞，這與CPIV血凝特性一致[13]:4℃或 25℃條件下能凝集雞、豬、兔、犬、豚鼠、羊、人“O”型血紅細胞；電鏡觀察期超微結構呈園形、長絲狀等不規(guī)則形態(tài)，與金昌德報道的一致[10]。

本研究從患犬組織中分離CPIV，并對N、HN和F基因進行擴增和測序，分析其變異情況。核苷酸和氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進化關系顯示，與10株有代表性的副流感病毒N基因相比，核苷酸同源性為 95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%。其中有兩處氨基酸發(fā)生新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號：JQ743324)同源性最低為97.4%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號：KC237063)同源性最高為99.6%。HN基因分析顯示，與10株有代表性的副流感病毒H基因相比，核苷酸同源性為95.5～99.8%，氨基酸同源性為96.3～99.6%，其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號：JQ743324)同源性最低為95.5%，與犬源副流感病毒分離株D277(登錄號：KC237065)同源性最高為99.6%。與10株有代表性的副流感病毒F基因相比，該毒株F基因核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為 95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成了S，89位由T變成了M。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號：JQ743324)同源性最低為95.6%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號：KC237063)同源性最高為99.6%。F基因的遺傳變異對于CPIV的預防有著重要影響，特別是重要抗原位點的變化可能導致疫苗的免疫保護不全面，那么本分離株F基因的變異是否能導致疫苗的免疫保護不全或者增加CPIV毒力變化值得進一步研究。N、HN和F基因序列分析還表明，犬副流感病毒流行毒株之間、氨基酸序列之間變化不大，但與其他相關毒株間差異相對較大，這與李長磊等研究結果一致[14]。

成功分離一株犬副流感病毒，該病毒在25℃條件能吸附豚鼠、雞、豬和人O型血紅細胞。電鏡觀察顯示病毒為圓形、長絲狀等形態(tài)多樣，大小不等的病毒粒子。N、HN和F基因序列分析顯示，該分離株與犬副流感病毒分離株08-1990(登錄號：KC237063)親緣關系最近；N基因氨基酸在第257位(由V變成了A)和第301位(由A變成了T)，F基因氨基酸在第56位(由T變成了S)和89位(由T變成了M)發(fā)生了特異性變異。

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Isolation and identification of canine parainfluenza virus and partial gene sequence analysis of the isolate

SUN Ming1, LIU Qiao-rong1, QIN Ya-man1, DENG Xiao-yu1, YANG Xin-yan1, LIU Bo-hua, CHEN Xi-Zhao1,2

(1. Beijing ANHEAL Laboratories Co. Ltd, Beijing 100094, China; 2. China Animal Disease Control Center, Beijing 100125)

【Abstract】ObjectiveTo isolate and identify canine parainfluenza virus (CPIV) from the a dog suspected of CPIV infection, then to analyze the gene sequence variation of N，HN and F genes and provide a molecular biology basis for the diagnosis, treatment, prevention and control of CPIV infection. Methods Samples of the lung tissue was taken from a dead dog suspected of CPIV infection, and were inoculated into Vero cells. CPE were observed after three blind passages, then the cell culture fluid after 72-hour-cultuere was assayed for further PCR identification, blood coagulation characteristics and morphological observation. Moreover, 3 pairs of oligonucleotide primers were designed, and N, HN and F complete genes of CPIV were amplified by RT-PCR from positive CPIV culture fluid. The genetic variation of the three genes were further analyzed by biological software, and phylogenetic trees were produced. ResultsOne strain of CPIV was isolated and named QF20100726. The results showed that the CPIV strain could agglutinate Guinea pig, pig,chicken and human o type blood cells,and had the basic ultrastructural chatacteristics of parainfluenza virus. Compared with 10 representative CPIV genes, N, HN and F gene phylogenetic analysis of the QF20100726 CPIV gene showed 95.7% to 99.8%, 94.7% to 99.6% and 94.7% to 99.6% nucleotide identity, respectively, and 97.4% to 99.6%, 96.3 to 99.6%, 95.6% to 99.3% amino acid identity, respectively. Of these aa substitutions, 2 substitutions (V208A, A301T) occurred in the N open reading frame (ORF), and 2 substitutions (T56S, T89M) occurred in the F open reading frame (ORF). ConclusionsOne strain QF20100726 of CPIv is successfully isolated, and the phylogenetic trees of N, HN and F genes from the QF20100726 CPIV strain show close phylogenetic relationship with other CPIV isolates. The data provide a valuable molecular biology basis for the studies on prevention and control of CPIV infection.

【Key words】CPIV, Viral isolation, Sequence analysis

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.016

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 02-0077-06

[作者簡介]孫明(1963-)，男，博士，研究方向：分子病毒學診斷技術。Email： sunming@anheal.com。[通訊作者]陳西釗(1965-)，男，博士，研究員，研究方向：動物傳染病與預防獸醫(yī)學。Email： chenxizhao@anheal.com。