硫化氫對組織因子誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血家兔體外凝血活性的影響

李乾坤　潘榆春　何　坤　賈大平　李　偉姜玉新王國光(皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽　蕪湖　24002)

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硫化氫對組織因子誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血家兔體外凝血活性的影響

李乾坤潘榆春何坤賈大平李偉1姜玉新1王國光1
(皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖241002)

〔摘要〕目的探討硫化氫對組織因子誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血( DIC)家兔凝血活性的影響。方法健康青紫藍(lán)家兔通過靜脈注射組織因子復(fù)制DIC模型。采用全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間( APTT)和凝血酶原時間( PT) ;凝聚法檢測血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物( FDP)。結(jié)果注射組織因子至5 min時，APTT和PT較注射前縮短( P＜0．05)，15、45 min時，APTT和PT較注射前延長( P＜0．05)，注射組織因子后的血樣品，F(xiàn)DP檢測均出現(xiàn)乳膠顆粒凝集;經(jīng)硫化氫處理，注射組織因子前血漿PT無明顯變化，中、高劑量組APTT延長( P＜0．05)，F(xiàn)DP檢測未出現(xiàn)乳膠顆粒凝集;注射組織因子5 min時，中、高劑量組PT較對照組延長( P＜0．05)，高劑量組APTT較對照組延長( P＜0．05) ; 15、45 min時，PT僅在高劑量時較對照組延長( P＜0．05)，APTT在中、高劑量時較對照組均延長( P＜0．05) ; FDP檢測，5和15 min時中、高劑量組的乳膠顆粒凝集較對照組明顯減弱，45 min時，各組的乳膠顆粒凝集均不明顯。結(jié)論硫化氫對實(shí)驗(yàn)性DIC動物體外凝血有一定的抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕硫化氫;彌散性血管內(nèi)凝血;凝血活性

1皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者:李乾坤( 1993－)，男，在讀本科生，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

彌散性血管內(nèi)凝血( DIC)病情發(fā)展快、病死率高，其發(fā)生是在各種致病因素下，血管內(nèi)皮損傷從而使內(nèi)皮下組織暴露激活內(nèi)源性凝血系統(tǒng)〔1〕，及內(nèi)皮損傷使組織因子入血激活外源性凝血系統(tǒng)所致;組織因子( TF)是啟動外源性凝血系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，而外源性凝血系統(tǒng)貫穿于凝血異常病程〔2〕。硫化氫因其有毒對環(huán)境造成污染、危害呼吸系統(tǒng)而為人們所熟知，但自上世紀(jì)末在腦組織中被發(fā)現(xiàn)后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其還廣泛存在于機(jī)體的幾乎各個組織〔3〕，并調(diào)節(jié)心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等諸多生理功能〔4〕，且參與許多病理過程〔5〕。但硫化氫對DIC凝血活性的影響作用尚未見報道。因此，本文旨在觀察硫化氫對TF誘導(dǎo)的急性DIC動物不同時期體外凝血活性的影響。

1材料與方法

1. 1 DIC模型的建立和分組健康青紫藍(lán)家兔( 1．5～2．0 kg)稱重后，以1．5%戊巴比妥鈉溶液2 ml/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺;然后頸部作切口，分離頸總動脈，并以硅膠管作動脈插管，采血3 ml。以靜脈注射兔腦組織TF復(fù)制DIC模型。TF使用前加5 ml蒸餾水輕搖混勻，溶解得到凍干兔腦組織TF懸液，37℃水浴15 min。將2 ml/kg兔腦組織TF溶解懸液稀釋至30 ml，經(jīng)耳緣靜脈按1 ml/min×5 min，2 ml/min×5 min，3 ml/min×5 min的速度注射以制備DIC模型。開始注射TF 5、15、45 min分別通過動脈插管采血3 ml;離心后取血漿用于相應(yīng)指標(biāo)的檢測。每份血漿隨機(jī)分成對照組、硫化氫處理低劑量、中劑量、高劑量組〔分別用25、50、100 μg/ml的硫氫化鈉(硫化氫的供體)處理，對照組為血漿〕。

1. 2觀察指標(biāo)采用全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間( APTT)和凝血酶原時間( PT) ;全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù);凝聚法檢測血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物( FDP)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2. 1硫化氫對PT的影響注射TF前各劑量組PT與對照組比較無明顯變化( P＞0．05) ;注射TF 5 min時，對照組PT與注射TF前比較明顯縮短( P＜0．05)，硫化氫處理組與注射TF前比較無明顯變化( P＞0．05)，但與相應(yīng)的對照組比較明顯延長( P＜0．05) ;注射TF 15 min時，與注射前無顯著性差別; 45 min時，各組PT較注射前明顯延長，且低劑量與中劑量硫化氫處理與對照組比較PT無明顯改變( P＞0．05)，高劑量使PT延長( P＜0．05)。見表1。

2. 2硫化氫對FDP的影響在FDP陰性對照檢測中，無乳膠顆粒凝集出現(xiàn); FDP陽性對照檢測有較多乳膠顆粒凝集出現(xiàn);注射TF前血樣品中，各組FDP檢測均未有乳膠顆粒凝集;而注射TF 5、15 min的血漿中，各組FDP檢測均出現(xiàn)乳膠顆粒凝集，且中、高劑量組的乳膠顆粒凝集較對照組明顯減弱;注射TF 45 min的血樣品的FDP檢測中，各組的乳膠顆粒凝集均不明顯。見圖1。

表1硫化氫對DIC模型家兔PT的影響(±s，s)

表1硫化氫對DIC模型家兔PT的影響(±s，s)

與注射TF前比較: 1) P＜0．05;與對照組比較: 2) P＜0．05;下表同

組別　　注射TF前　5 min　 15 min　 45 min對照組　9．6±0．8　 8．1±0．61)　10．3±0．8　 10．9±1．41)低劑量組　9．5±1．3　 9．1±0．52)　10．5±1．5　 11．5±1．71)中劑量組　9．8±1．6　 9．3±0．92)　11．0±1．8　 12．0±1．41)高劑量組　10．0±1．5　 9．5±0．72)　11．5±1．12)13．4±1．51) 2)

－:陰性對照; +:陽性對照; 1～5、6～10、11～15、16～20分別為注TF前、5、15、45 min時對照組、生理鹽水組、低劑量、中劑量、高劑量組圖1硫化氫對FDP的影響

2. 3硫化氫對APTT的影響以不同濃度的硫化氫處理注射TF前的血樣品，低劑量組APTT與對照組比較無明顯變化( P＞0．05)，中、高劑量組APTT明顯延長( P＜0．05) ;注射TF 5 min時，各組的APTT與注射TF前比較明顯縮短( P＜0．05)，低、中劑量組與對照組比較，APTT無明顯變化( P＞0．05)，但高劑量組比較明顯延長( P＜0．05) ;注射TF 15、45 min時，APTT比注射前明顯延長( P＜0．05)，且低劑量硫化氫處理對APTT無明顯改變( P＞0．05)，中、高劑量則使APTT延長( P＜0．05)。見表2。

表2氫硫化對DIC模型家兔APTT的影響(±s，s)

表2氫硫化對DIC模型家兔APTT的影響(±s，s)

組別　　注射TF前　5 min　 15 min　 45 min對照組　31．7±2．1　 29．7±1．61)46．4±8．71)54．9±6．81)低劑量組　34．5±2．7　 31．8±2．21)51．3±6．91)61．45±9．31)中劑量組　37．8±3．32)　33．3±2．81)55．1±7．61) 2)66．3±6．01) 2)高劑量組　42．2±5．32)36．8±4．11) 2)58．6±7．31) 2)68．1±6．41) 2)

3討論

DIC是由某些致病因子作用而使血液中的凝血因子和血小板相繼被激活，并在微血管中形成大量的微血栓，伴隨凝血因子及血小板的大量消耗，激發(fā)激活纖溶系統(tǒng)，并導(dǎo)致凝血障礙的病理過程。作為新發(fā)現(xiàn)的又一內(nèi)源性信號分子〔6〕，有研究表明，硫化氫預(yù)處理可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化作用，減輕組織損傷〔7〕。此外，硫化氫還有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn)硫化氫具有抑制血小板聚集及阻止血栓形成的作用〔8〕，前期的研究工作發(fā)現(xiàn)硫化氫預(yù)處理對TF誘發(fā)的DIC有保護(hù)作用。

DIC的發(fā)生是由于許多病因引起的凝血－抗凝血平衡紊亂，并在微循環(huán)形成廣泛的微血栓的一種臨床綜合征。內(nèi)、外源凝血系統(tǒng)的激活導(dǎo)致凝血酶大量產(chǎn)生，使血液凝血活性增強(qiáng)而呈高凝狀態(tài)，因而在微循環(huán)形成大量微血栓。微血栓的形成使凝血因子及血小板等被大量消耗，使血液凝血活性下降而轉(zhuǎn)為低凝狀態(tài)。TF是激活外源性凝血系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，外源性凝血系統(tǒng)的激活在DIC的發(fā)生中起著重要作用〔2〕，因此常被用于復(fù)制急性DIC模型。本研究表明，由于凝血因子的消耗，凝血活性減低，到45 min時，PT及APTT較5 min時進(jìn)一步延長，凝血障礙加劇。PT主要反映外源性凝血是否正常〔9〕。APTT測定中的白陶土可激活凝血因子Ⅺ和Ⅻ，以腦磷脂(部分凝血活酶)代替血小板3因子，因此，APTT為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較敏感和常用的篩選試驗(yàn)。本研究結(jié)果提示硫化氫可能通過對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)作用而影響正常血液的凝血活性;低劑量硫化氫即可抑制高凝狀態(tài)外源性凝血系統(tǒng)的凝血活性，對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)凝血活性的抑制需較高劑量硫化氫，這些結(jié)果提示在高凝期時，硫化氫可能對外源性凝血系統(tǒng)較為敏感，尤其在較低劑量對血漿凝血活性的抑制作用可能主要是通過抑制外源性凝血系統(tǒng);在低凝期硫化氫對APTT較敏感，對血漿凝血活性的抑制作用所需劑量較高，可能與血小板在DIC發(fā)展過程中的消耗有關(guān)〔8〕。但硫化氫對DIC發(fā)生發(fā)展過程中血漿凝血活性的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究表明硫化氫對TF誘發(fā)的DIC血漿的凝血活性具有抑制作用，并且高凝期時，低劑量的硫化氫即可抑制外源性凝血系統(tǒng)，而低凝期則需較高劑量抑制內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015－06－17修回〕

(編輯袁左鳴)

Effects of hydrogen sulfide on in vitro coagulation activity in rabbits with tissue factor-induced DIC

LI Qian-Kun，PAN Yu-Chun，HE Kun，et al.
Clinical Medical College，Wannan Medical College，Wuhu 241002，Anhui，China

【Abstract】Objective To explore the effects of sodium sulfide on in vitro coagulation in rabbits with tissue factor－induced disseminted intravascular coagulation( DIC)．Methods DIC model was prepared by intravenous injection of tissue factor( TF)．Every plasma was assigned into sodium sulfide( treated with 25，50，100 μg/ml sodium bisulfide)，normal saline and control groups．Prothrombin time( PT)，activated partial thromboplastin time( APTT)，and fibrin degradation products( FDP) were determined．Results At 5 min of injection: PT in rabbits treated with sodium bisulfide and APTT in high dose group were significantly prolonged( P＜0．01，P＜0．05)，F(xiàn)DP agglutination was abated in middle and high dose groups; at 15 and 45 min，PT in high dose and APTT in middle and high dose group were prolonged( P＜0．05，P＜0．01)，F(xiàn)DP agglutination was abated in middle and high dose groups．When compared with the prior injection of tissue factor，5 min: PT in control and negative groups，and APTT in all groups were shortened( P＜0．05，P＜0．01)，F(xiàn)DP agglutination was enhanced in all groups; at 15 min，there was not any difference in PT among all groups，APTT was prolonged in all groups( P＜0．05)，F(xiàn)DP agglutination was prolonged in all groups; at 45 min，PT and APTT were prolonged in all groups( P＜0．05，P＜0．01)，F(xiàn)DP agglutination was little．Conclusions Hydrogen sulfide inhibits in vitro coagulation activity in rabbits with TF－induced DIC by its inhibitor to activating coagulation factor．

【Key words】Hydrogen sulfide; Disseminated intravascular coagulation; Coagulation activity

通訊作者:王國光( 1969－)，男，副教授，主要從事彌散性血管內(nèi)凝血研究。

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 81172790) ;安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目( AH201310368098)

〔中圖分類號〕R552

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0257-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 001