老年大鼠股骨頸骨折術后神經營養因子、乙酰膽堿轉移酶及突觸素的改變

凌云志　禹　莉梁啟勝　李曉紅　林學武　(蚌埠醫學院第一附屬醫院麻醉科，安徽　蚌埠　233004)

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老年大鼠股骨頸骨折術后神經營養因子、乙酰膽堿轉移酶及突觸素的改變

凌云志禹莉1梁啟勝李曉紅林學武(蚌埠醫學院第一附屬醫院麻醉科，安徽蚌埠233004)

〔摘要〕目的探討老年大鼠股骨頸骨折術后對血清膠質細胞系來源的神經營養因子( GDNF)、乙酰膽堿轉移酶( CHAT)及海馬內突觸素蛋白表達的影響。方法SD老年大鼠35只隨機分為三組:空白組( K組，n=7)、對照組( D組，n= 14)、手術組( S組，n= 14)。D、S組根據處理時間不同各分2個亞組，D1、D3、S1、S3組(每組7只)。酶聯免疫吸附法( ELISA)檢測血清GDNF、CHAT濃度，HE染色檢測海馬組織病理變化，免疫組化檢測海馬內突觸素蛋白的表達。結果S組血清GDNF、CHAT濃度均降低，與K組、D組相比差異顯著( P＜0．05) ; HE染色顯示D組和S組神經細胞缺失，形態改變;免疫組化結果表明D組和S組突觸素表達較K組明顯下降( P＜0．01，P＜0．05)。結論老年大鼠股骨頸骨折術后大鼠的空間學習記憶能力下降可能與血清GDNF、CHAT濃度降低，海馬內突觸素蛋白表達下調有關。

〔關鍵詞〕股骨頸骨折;神經營養因子;乙酰膽堿轉移酶;突觸素

1蚌埠醫學院醫學檢驗系

第一作者:凌云志( 1977－)，男，博士，主治醫師，講師，主要從事麻醉腦保護研究。

術后認知功能障礙( POCD)是一種麻醉、手術后較為嚴重的神經系統并發癥，是指手術后數天內發生的意識、認知、定向、思維、記憶以及睡眠等方面的紊亂，是老年患者術后早期較為顯著的問題〔1〕。臨床觀察到骨科手術后，POCD的發生率相對較高，Berggren等〔2〕發現老年患者股骨頸骨折固定術后POCD的發生率高達44 %，由于病因仍不很清楚，給臨床上預防和治療帶來一定困難。本課題組前期研究結果表明〔3〕老年大鼠股骨頸骨折術后可暫時影響大鼠的空間學習記憶能力，可能與血清Aβ1～40濃度升高以及海馬內Bcl－2/Bax比例降低有關。本實驗進一步探討POCD的發生機制。

1材料與方法

1. 1實驗動物及分組35只健康雄性清潔級SD大鼠由浙江省實驗動物中心提供，合格證號: SCXK(浙) 20080033。月齡18～20個月，體質量450～500 g，實驗前12 h禁食不禁水。采用隨機數字表法分為五組: K組( n = 7)為空白組，不做任何麻醉及手術處理; D組( n = 14)為對照組，僅制作股骨頸骨折模型; S組( n=14)為手術組，制作股骨頸骨折模型，麻醉后行股骨頸骨折內固定術。D組、S組大鼠根據處理時間的不同各分為2個亞組，每組7只，分別為處理后1、3 d組(即D1、D3; S1、S3組)。

1. 2手術處理老年大鼠左股骨頸骨折模型制作成功后，行2%戊巴比妥鈉2．5 ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠翻正反射消失后仰臥位固定，保持氣道通暢。切開右腹股溝皮膚，游離暴露股靜脈，然后進行小兒B－D套管針置管，建立靜脈通道，乳酸鈉林格注射液靜脈維持輸液，固定包埋套管針，縫合皮膚。常規消毒鋪巾，在左側股骨頸骨折部位，選擇后外切口，切開皮膚、筋膜，分離肌層，暴露骨折斷端，使用1．0 mm克氏針行骨折斷端交叉固定，徹底止血后，逐層關閉縫合傷口，青霉素鈉粉劑灑在傷口表面，術中呼吸平穩。術后傷口愈合好，分籠喂養，無手術死亡。

1. 3材料大鼠膠質細胞系來源的神經營養因子( GDNF) ELISA試劑盒及乙酰膽堿轉移酶( CHAT) ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司) ;兔抗突觸素抗體(美國Santa Cruz生物技術公司) ;免疫組化染色試劑盒(美國ZYEMD公司生產，北京中杉金橋生物技術有限公司分裝)

1. 4方法

1. 4. 1取材抽取各組大鼠心臟血液2 ml，放置30 min自然凝固后，3 000 r/min離心10 min，取上清，－20℃保存用于檢測血清GDNF和CHAT，試劑盒及檢測均由上海雅吉生物科技有限公司完成。斷頭處死，迅速開顱取腦，于冰臺上分離出海馬組織，10 %甲醛固定24 h用于HE和免疫組化檢測。

1. 4. 2 HE和免疫組化染色取甲醛固定的海馬組織常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。冠狀切片，片厚4 μm，行HE染色，光鏡觀察海馬CA1區組織形態學變化，其余標本行SP免疫組化染色。脫蠟至水，3%過氧化氫封閉15 min，PBS沖洗，加入兔抗突觸素抗體(稀釋比例為1∶150)，為排除非特異性染色，部分切片以PBS代替一抗，37℃孵育2 h，PBS沖洗，加入即用型Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片。海馬區出現黃褐色點狀或顆粒狀為陽性。在顯微鏡( Olympus，Japan)下觀察突觸素蛋白的表達，用圖像分析系統( Image Pro Plus 6．0，美國)測其平均灰度值。

1. 5統計學方法采用SPSS16．0軟件行單因素方差分析及q檢驗。

2結果

2. 1血清GDNF和CHAT檢測與K組相比，D組、S組血清GDNF、CHAT濃度均降低( P＜0．01，P＜0．05)，與D1組、D3組分別相比，S1組、S3組差異均有統計學意義( P＜0．01，P＜0．05)。見表1。

表1各組大鼠血清GDNF和CHAT濃度比較( n=7±s)

表1各組大鼠血清GDNF和CHAT濃度比較( n=7±s)

與K組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;與D1組比較3) P＜0．05，4) P＜0．01;與D3組比較: 5) P＜0．05，6) P＜0．01

組別　GDNF( ng/L)　CHAT( pmol/L) K組　84．16±6．62　323．11±49．49 D1組　69．76±9．682)　262．60±28．432)D3組　71．88±8．371)　281．74±29．691)S1組　56．58±12．062) 3) 5)　193．38±38．372) 4) 6)S3組　58．75±9．492) 3) 6)　216．47±39．452) 3) 6)F/P值　9．780/＜0．01　13．054/＜0．01

2. 2 HE染色結果K組海馬CA1區神經細胞排列整齊緊密，形態完整，數量較多，胞質豐富，胞核飽滿，大而圓，著色均勻，深染，核仁清晰。D1和D3組與K組相比，神經細胞有缺失，數量減少，細胞排列散亂，膠質細胞稀疏變性，S1和S3組與K組相比，神經細胞缺失更明顯，殘留的神經細胞排列松散不規則，邊界模糊，邊緣出現空泡，胞核不規則，有的胞核消失，染色較淺，細胞數量明顯減少，神經元胞體變小，見圖1。

2. 3免疫組化檢測結果從圖2可以看出突觸素免疫反應陽性產物呈板層分布，神經元內免疫陽性物質為棕黃色點狀或顆粒狀沉積。有些顆粒圍繞在神經元周圍，襯托出神經元胞體的輪廓。K組海馬神經細胞周圍突觸素陽性染色顆粒較密集，染色較深且明顯，錐體細胞排列緊密，整齊，結構清晰。D1和D3組海馬神經細胞周圍突觸素陽性染色顆粒明顯減少，稀疏，錐體細胞排列較疏松，細胞層次減少。S1和S3組突觸素免疫陽性顆粒數量減少更明顯，染色較淺且分布更為稀疏，低于K組和D組。定量分析結果顯示D1和D3組海馬CA1區突觸素免疫反應產物的平均光密度值〔( 124．71±22．71)、( 119．29± 13．49)〕較K組〔( 147．14±21．88)〕明顯降低，突觸素表達下降( P＜0．05)，S1和S3組〔( 93．57±15．99)、( 96．86±18．63)〕較K組突觸素表達平均灰度值降低更明顯( P＜0．01)，S1和S3組分別與D1和D3組相比差異顯著( P＜0．01，P＜0．05)。

圖2各組突觸素蛋白表達的結果( DAB，×100)

3討論

GDNF來源于神經膠質細胞，是GDNF家族中的主要成員之一，發揮營養神經、抑制神經元變性壞死等作用，是對神經細胞的存活、增殖、分化、凋亡和軸突形成等多方面起調節作用的GDNF〔4，5〕。在神經系統發育中GDNF存在多種相互關聯的信號傳導通路，能夠促進發育中神經元的存活、分化及正確遷移〔6〕。GDNF還可以對由各種原因造成損傷后的神經細胞有保護和修復作用〔7〕。研究報道，GDNF的缺乏與AD的發病密切相關〔8〕。有研究表明，將人胚胎神經干細胞植入外傷性腦損傷大鼠受損海馬部位時大量表達和釋放GDNF，并顯著改善認知功能，動物空間學習和記憶能力顯著提高〔9〕。本實驗結果說明老年大鼠股骨頸骨折術后，血清GDNF濃度降低，這可能是影響老年大鼠股骨頸骨折術后認知功能障礙的原因之一。

乙酰膽堿作為腦內廣泛分布的重要神經遞質，與學習記憶的關系極為密切。CHAT是乙酰膽堿合成的限速酶，可作為膽堿能神經元活性的標志，癡呆老齡鼠學習記憶能力降低與膽堿能神經密切相關，進一步的實驗證明CHAT活性變化能夠判斷膽堿能神經功能，CHAT活性降低是導致學習記憶障礙的重要原因〔10，11〕。Dunbar等〔12〕研究發現水迷宮作業表現較好的大鼠海馬中乙酰膽堿化酶活性和膽堿攝取量較高。腦的活栓和尸檢清楚地顯示在老年性癡呆患者腦皮層CHAT活性顯著降低，且CHAT水平與神經炎性斑和MMSE簡易智能量表成績高度相關。本實驗結果說明老年大鼠股骨頸骨折術后血清CHAT濃度降低，這可能是導致老年大鼠股骨頸骨折術后學習記憶能力下降，發生術后認知功能障礙的原因之一。

海馬是神經元退行性變發生的易感區域，海馬神經元的退變和丟失是正常老化的最常見的特點，也是導致與老化相關的學習記憶功能減退的直接原因。本文結果說明老年大鼠股骨頸骨折術后發生神經元細胞的缺失與退變，從而導致學習記憶功能的減退。

突觸是神經元之間的功能接觸部位，其結構和功能的完整對神經元的信息傳遞、加工和貯存十分重要。學習記憶與中樞神經系統突觸的結構和功能的可塑性密切相關。突觸素是一種與突觸結構和功能密切相關的膜蛋白，可作為突觸前終末特異性標記物用來客觀反應突觸的密度和分布，已有研究〔13〕發現突觸素免疫活性與AD患者的認知障礙程度相關。本實驗結果說明老年大鼠股骨頸骨折術后突觸素表達明顯下降，反映了突觸數量的減少和突觸素合成能力的減弱，突觸素減少將導致神經系統的信息傳遞、加工和儲存出現障礙，神經遞質釋放異常，最終出現行為功能異常。老年大鼠股骨頸骨折術后出現學習記憶功能減退可能與突觸素蛋白表達的減少有直接關系。

綜上所述，膠質細胞系來源的GDNF、膽堿能神經元的特異性標志酶CHAT和神經元突觸的特異性標志物突觸素對于維持學習記憶功能具有關鍵的作用，本研究表明，老年大鼠在股骨頸骨折術后血清GDNF和CHAT濃度的降低、海馬突觸素蛋白表達減少可能是導致老年大鼠股骨頸骨折術后學習記憶能力減退的重要機制。GDNF、CHAT和突觸素能否作為術后認知功能障礙早期預測指標和治療的靶點還有待于進一步的實驗和臨床研究。

4參考文獻

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3凌云志，禹莉，梁啟勝，等．老年大鼠股骨頸骨折術后認知功能及Aβ1－40、Bax、Bcl－2改變的研究〔J〕．中國老年學雜志，2013; 33( 18) : 4489－91．

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〔2014－12－19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者:禹莉( 1979－)，女，碩士，副教授，主要從事診斷分子生物學研究。

基金項目:安徽省高等學校自然科學研究一般項目( KJ2015B004by) ;蚌埠醫學院重點課題( BYKY1424ZD)

〔中圖分類號〕R614. 4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0287-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 014